自噬幹貨分享系列之分子伴侣介導的自噬

前幾期給大家展現了經典自噬、內質網自噬和線粒體自噬，本期將從分子伴侣介導的自噬簡述、分子伴侣介導的自噬應用實例、漢恒生物分子伴侣介導的自噬研究工具這三個方面給大家詳細全面的展現下分子伴侣介導的自噬。

什麽是分子伴侣介導的自噬（CMA）

分子伴侣介導的自噬主要通過分子伴侣識別蛋白質序列上的一段特殊基序，將蛋白轉運到溶酶體內進行降解的過程。其大致流程見圖1：Ⅰ、分子伴侣熱休克同源蛋白70（HSC70）識別帶有KFERQ基序的底物；Ⅱ、HSC70-底物復合體與溶酶體相關膜蛋白2A型（LAMP2A）相結合；Ⅲ、分子伴侣對底物進行去折叠，形成CMA易位復合體；Ⅳ、LAMP2A多聚化介導的底物易位，溶酶體蛋白酶對底物進行降解，LAMP2A從易位復合體中解離。

圖1 分子伴侣介導的自噬模式圖

通常情況下，肝臟、肾臟、大腦等組織或培養物中的幾乎所有不同細胞類型中均可以檢測到一定程度的CMA活性，而細胞應激狀態下則最大程度地激活了這一途徑，饑餓、氧化劑、促氧化劑和蛋白質變性毒素均會引起CMA的活化。CMA通過選擇性識別和降解細胞過程中的某些蛋白，對細胞活動做到精確調控，其潛在性能研究也逐漸成為自噬研究的熱點。

分子伴侣介導的自噬（CMA）應用實例

無論是在科研界摸爬滾打多年的資深科研er，還是剛入科研大門的萌新，相信都對“自噬”這個熱點耳熟能詳。有人會說，自噬已經是過去式，作為熱點也有點“過氣”，不值得再據此策劃課題。

小恒看到這樣的評論只能說：NoNoNo！熱點之所以能成為熱點，從來都是與時俱進，追蹤科學最前沿的。你以為的老熱點“自噬”，實際上是被投入較多關註的“巨自噬”（也稱為“大自噬”），不受待見的原因也是有太多套路化研究。然而，自噬的另外一種：“分子伴侣介導的自噬”（chaperone mediated autophagy, CMA），仍然具有創新和挖掘的潛力。

下面我們就來看看在分子伴侣介導的自噬範圍，有哪些研究吧！

2022年4月4日羅馬大學生物系Enrico Desideri教授團隊在Autophagy (IF=13.391)上發表了一篇名為：“Impaired degradation of YAP1 and IL6ST by chaperone-mediated autophagy promotes proliferation and migration of normal and hepatocellular carcinoma cells”的研究論文，證明了在人肝細胞癌和肝細胞系中，YAP1和IL6ST是分子伴侣介導的自噬（CMA）的新底物。敲除溶酶體CMA受體LAMP2A會增加YAP1和IL6ST的蛋白水平，但不會改變mRNA的表達。此外，這兩種蛋白都顯示依賴於KFERQ與CMA伴侣HSPA8的結合，並在長期饑餓刺激CMA後積聚到分離的溶酶體中。進一步研究表明LAMP2A下調促進了肝癌細胞和人肝細胞系的增殖和遷移，並且它是以YAP1和IL6ST依賴的方式做到這一點的。最後，在人肝細胞癌組織中，LAMP2A表達下調，YAP1和IL6ST表達上調。綜上所述，該工作揭示了一種新的機製，控製了兩種癌癥相關蛋白的逆轉，並暗示了CMA在肝臟中的腫瘤抑製性能，有望利用CMA活性用於癌癥診斷和治療。

圖2 YAP1和IL6ST是CMA底物

2022年4月1日西班牙IBIONS–Instituto的Julio Madrigal-Matute教授團隊在PNAS (IF=12.779)期刊上發表了一篇名為：“Protective role of chaperone-mediated autophagy against atherosclerosis”的研究論文，該研究顯示小鼠和人動脈中血管平滑肌細胞和巨噬細胞的CMA活性降低，以應對動脈粥樣硬化的挑戰。在體內，受阻的CMA基因通過系統性和細胞自主性改變血管平滑肌細胞和巨噬細胞，加重動脈粥樣硬化的病理，這兩種細胞類型參與了動脈粥樣硬化的形成。CMA缺乏可促進血管平滑肌細胞的去分化和巨噬細胞的促炎狀態。相反，CMA上調的遺傳小鼠模型顯示出較低的動脈粥樣硬化易感性。作者認為CMA可能是治療心血管疾病的一個有吸引力的靶點。

圖3 CMA對抗動脈粥樣硬化前損傷的全身和血管反應

漢恒生物分子伴侣介導自噬（CMA）研究工具

CMA底物的識別主要發生在胞漿內，所有CMA底物均含有一個可被HSC70識別的五肽樣基序（KFERQ序列），該基序由以下氨基酸殘基組成，一個恒定的氨基酸殘基谷氨酰胺（Q），一個堿性氨基酸殘基賴氨酸（K）或精氨酸（R），一個疏水性氨基酸殘基苯丙氨酸（F）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）或異亮氨酸（I），一個酸性氨基酸殘基谷氨酸（E）或天門冬氨酸（D），最後以一個以上所描述的堿性或疏水性氨基酸殘基結尾。KFERQ序列保證了這種蛋白降解途徑的嚴格選擇性。

研究發現將蛋白質變化構象理論計算與光遺傳學相結合，可以開發出受特定波長光調控的光激活蛋白，其與普通荧光蛋白具有相似的遺傳學特性，另一方面，其在特殊的激光刺激下會產生一些特異性的變化，如亮度變化、顏色變化等。PAmCherry1作為一種光活化蛋白，本身無自發荧光，需在405nm波長的光暴露5-10分鐘進行活化後，才可被激活發出紅色荧光（激發564nm，發射595nm），使用這類荧光蛋白可降低高自發荧光或累積自發荧光色素沈積物對細胞觀察的影響。

漢恒生物基於以上原理，構建了KFERQ-PAmCherry1探針和PAmCherry1-KFERQ-NE探針，可用於感染目的細胞後直觀地觀察分子伴侣介導自噬的變化。KFERQ-PAmCherry1探針借助分子伴侣所識別的底物的基序KFERQ與光活化蛋白PAmCherry融合，使其轉化為CMA底物，當靶向溶酶體時便可通過觀察紅色荧光斑點數量來檢測活細胞中的CMA活性（圖4-a）。而PAmCherry1-KFERQ-NE探針是在KFERQ-PAmCherry1的基礎上增加了一種新型18個氨基酸的表位標簽“NE”，這種標簽能夠用於特異性免疫檢測和定量PAmCherry1-KFERQ蛋白表達量，滿足多種實驗需求，可謂是在KFERQ-PAmCherry1探針的基礎上錦上添花。

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圖4 KFERQ-PAmCherry1工作原理圖

至此，本期內容就結束了，主要展現了分子伴侣介導的自噬的概念，應用實例和研究工具。對于自噬範圍的幹貨分享就到這裏啦，收官大吉！下期我們將推送假病毒相關幹貨知識，恭迎友友們訂閱關註。

參考文獻

1. Koga H, Martinez-Vicente M, Macian F, Verkhusha VV, Cuervo AM. A photoconvertible fluorescent reporter to track chaperone-mediated autophagy. Nat Commun. 2011 Jul 12;2:386. doi: 10.1038/ncomms1393.

2. Ho PW, Leung CT, Liu H, Pang SY, Lam CS, Xian J, Li L, Kung MH, Ramsden DB, Ho SL. Age-dependent accumulation of oligomeric SNCA/α-synuclein from impaired degradation in mutant LRRK2 knockin mouse model of Parkinson disease: role for therapeutic activation of chaperone-mediated autophagy (CMA). Autophagy. 2020 Feb;16(2):347-370. doi: 10.1080/15548627.2019.1603545.

3. Lee W, Kim HY, Choi YJ, Jung SH, Nam YA, Zhang Y, Yun SH, Chang TS, Lee BH. SNX10-mediated degradation of LAMP2A by NSAIDs inhibits chaperone-mediated autophagy and induces hepatic lipid accumulation. Theranostics. 2022 Feb 21;12(5):2351-2369. doi: 10.7150/thno.70692.

4. Fan Y, Hou T, Gao Y, Dan W, Liu T, Liu B, Chen Y, Xie H, Yang Z, Chen J, Zeng J, Li L. Acetylation-dependent regulation of TPD52 isoform 1 modulates chaperone-mediated autophagy in prostate cancer. Autophagy. 2021 Dec;17(12):4386-4400. doi: 10.1080/15548627.2021.1917130.

5. Desideri E, Castelli S, Dorard C, Toifl S, Grazi GL, Ciriolo MR, Baccarini M. Impaired degradation of YAP1 and IL6ST by chaperone-mediated autophagy promotes proliferation and migration of normal and hepatocellular carcinoma cells. Autophagy. 2023 Jan;19(1):152-162. doi: 10.1080/15548627.2022.2063004.

6. Madrigal-Matute J, de Bruijn J, van Kuijk K, Riascos-Bernal DF, Diaz A, Tasset I, Martín-Segura A, Gijbels MJJ, Sander B, Kaushik S, Biessen EAL, Tiano S, Bourdenx M, Krause GJ, McCracken I, Baker AH, Jin H, Sibinga NES, Bravo-Cordero JJ, Macian F, Singh R, Rensen PCN, Berbée JFP, Pasterkamp G, Sluimer JC, Cuervo AM. Protective role of chaperone-mediated autophagy against atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Apr 5;119(14):e2121133119. doi: 10.1073/pnas.2121133119.