舉例：③號管對應孔的荧光比例為30%，細胞總數為8×10⁴，滴度（TU/mL）=8×10⁴×30%×10³ /0.1=2.4×10⁸如果要感染2×10⁵個細胞，MOI=30（1個細胞對應30個病毒粒子）（見下註），則需要病毒體積為=2×10⁵×30/2.4×10⁸（mL）=0.025mL=25μL.

註：MOI值:MOI是multiplicity of infection的縮寫，中文譯為感染復數,實際的含義即為每個細胞被多少個有活力病毒所感染。各種細胞的最適MOI值有差別，請顧客正式實驗前先進行預實驗摸索最適MOI。

定量PCR法檢測整合到基因組DNA中的病毒序列

可用於不帶荧光標記的慢病毒

1. 病毒感染細胞

① 感染前6 h在24孔板中以2.5×10E+5細胞/孔均勻接種HEK293細胞。

② 將慢病毒進行梯度稀釋，共做3個梯度，即每孔（500μL無雙抗、無血清的DMEM培養基）中含10 μL、1 μL、0.1 μL 病毒，振蕩混勻後加至接種好細胞的24孔板。

③ 感染 18-20h後，將培養板中的培養基更換為新鮮的DMEM完全培養基。

④感染 64-68h 後收集細胞並進行基因組DNA的提取。

2.基因組DNA qPCR檢測

① 提取各孔細胞基因組DNA。

② 以被測慢病毒載體梯度稀釋為標準品，慢病毒載體上的通用引物進行qPCR以獲得病毒整合拷貝數。

③ 以Actin質粒梯度稀釋為標準品，Actin引物進行qPCR檢測樣品的基因組拷貝數以得到基因組拷貝數。

3.計算慢病毒滴度IU/mL

IU/mL=(C×N×D×1000)/V

C：平均每基因組慢病毒整合拷貝數；

D：病毒稀釋倍數；

N：感染時細胞數目（2.5×10E+5）；

V：加入稀釋病毒的體積。

三、p24蛋白ELSIA試劑盒法測定慢病毒滴度

p24蛋白是慢病毒外殼中含量較高標誌性蛋白。p24 ELISA法測量病毒上清液中p24衣殼蛋白的量，然後將p24的含量水平與病毒滴度關聯起來。

檢測原理：采用固相酶聯免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測樣品中的HIV-1 p24抗原。慢病毒樣品中HIV-1 p24抗原與固相抗-p24單克隆抗體和生物素標記的抗-p24多克隆抗體通過免疫反應，形成固相抗-p24單克隆抗體—p24抗原—抗-p24多克隆抗體-生物素復合物；然後加入HRP（Horseradish Peroxidase，辣根過氧化物酶）標記的鏈親和素，形成固相抗-p24單克隆抗體—p24抗原—抗-p24多克隆抗體-生物素—鏈親和素-HRP復合物；加入TMB-H2O2底物溶液，HRP催化H₂O₂氧化TMB生成藍色的產物（更大吸收峰655nm），加入終止液終止酶催化反應，生成黃色產物（更大吸收峰450nm）。其吸光度與校準品和樣品中的HIV-1 p24抗原濃度成正相關。通過建立標準樣品曲線可得出樣品中 HIV-1 p24抗原濃度。

其主要步驟為（詳細方法參見市售的p24 ELISA試劑盒）：

(1) 樣品準備和稀釋

(2) 標準曲線樣品製備

(3) 樣品檢測

(4) 檢測數據分析

值得註意的是，該方法最終得出的樣品中p24蛋白的含量，單位為pg/mL，是物理單位。

要區別於活性單位TU/mL，因此，采用不同方法檢測的病毒滴度在病毒感染細胞時根據滴度需要加入的病毒量也有所差異。

四、qRT-PCR試劑盒檢測病毒樣本中的基因組拷貝數

檢測原理：用特異性引物能夠對以HIV-1為結構基礎的慢病毒樣品的RNA基因組的保守序列進行特異性擴增，通過qRT-PCR對產物進行實時監測。用標準品擴增得到的CT值繪製標準曲線，將待測病毒樣本反應的CT值帶入標準曲線，計算得到病毒樣本中的RNA基因組拷貝數，即病毒顆粒數（copies/mL）。

對于qRT-PCR法測定病毒樣品中RNA的方法操作步驟詳細請參考對應的試劑盒說明書。

慢病毒滴度測定方法總結

慢病毒滴度檢測方法

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