Long non-coding RNA NORAD/miR-224-3p/MTDH axis contributes to CDDP resistance of esophageal squamous cell carcinoma by promoting nuclear accumulation of β-catenin
（雜誌:Molecular Cancer，IF=27.401，河北醫科大學）
MicroRNA（miRNA）是一類內生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA，一個miRNA可以靶向幾個不同基因進行調節，同時幾個miRNAs也可以調節同一個基因。MiRNA可以與編碼基因mRNA的3’UTR結合也可以直接與circRNA或lncRNA結合來調控相關基因的表達。
漢恒生物所使用的荧光素酶報告基因載體psi-CHECK2采用了萤火蟲/海肾雙荧光素酶雙報告基因系統，其中海肾荧光素酶作為檢測報告基因，而萤火蟲荧光素酶則作為內參報告基因。驗證miRNA與mRNA/lncRNA/circRNA的互作，將要研究的靶點序列（序列可以是mRNA的3’UTR，也可以是lncRNA/circRNA序列）插入到報告載體中，作為萤火蟲荧光素酶的3‘UTR，與miRNA的mimic共同轉染細胞，如果荧光素酶表達量下降（荧光信號下降），提示序列包含miRNA的靶點。
在驗證circRNA/lncRNA與miRNA的靶點產生競爭性結合時，可以在轉染報告質粒和mimics的基礎上轉染認為有競爭結合位點的circRNA/lncRNA過表達質粒或者將具有競爭性結合位點的circRNA/lncRNA敲低，觀察R-Luciferase活性的改變。當過表達circRNA/lncRNA時荧光素酶活性升高，或者敲低circRNA/lncRNA時荧光素酶活性降低則表明他們之間存在對miRNA的競爭性結合，反之則不存在競爭性結合。
pSI-check2 質粒圖譜
驗證mir與其靶基因的相互作用最常用的方法便是雙荧光素酶驗證試驗。
荧光素(Luciferase)是自然界中能夠產生生物發光的酶的統稱，其中最有代表性的是來自萤火蟲 (Firefly) 體內和海肾(Renilla)體內的兩類萤光素酶，分別命名為F-Luciferase和R-Luciferase。
這兩種荧光素酶作用方式不同。一是底物和輔助因子不同，萤火蟲荧光素酶需要荧光素、O2、ATP 和 Mg2+，而海肾荧光素酶僅需要腔腸素（coelenterazine）和 O2。二是發光顏色不同，萤火蟲荧光素酶產生黃綠色光，發光波長為 560 nm；而海肾荧光素酶產生藍光，發光波長為 465 nm。常應用於啟動子轉錄活性調控及miRNA靶基因驗證等研究。
microRNA與靶基因結合驗證：驗證microRNA與靶基因（mRNA，lncRNA,circRNA）結合作用
ceRNA作用研究：驗證不同把好基因對microRNA的競爭性結合作用
1、啟動子報告質粒構建
2、miRNA靶基因報告質粒構建
3、單（雙）荧光素酶檢測試劑盒
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