明星商品
幹貨推選
關註我們
掃碼關註我們
了解另外信息
CRISPR-Cas9系統是基於原核生物適應性免疫機製改造的基因編輯技藝。其包含兩個模塊，一是識別特異DNA序列的gRNA及其骨架，二是結合和編輯DNA的蛋白質Cas9。自被發明以來，該技藝快速擴展，目前CRISPR-Cas9及其變體已經被廣泛應用於活細胞內核酸的編輯、檢測、標記、成像等各個範圍。由於其在不同物種中所參考出的高效易用的特點，該技藝已經革新了基礎生命科學和生物醫學的研究方式。該技藝的發明人也被授予了2020年諾貝爾化學獎。如今CRISPR-Cas系統仍在蓬勃擴展，無論在基礎科學研究範圍還是在基因治療、細胞治療等臨床應用範圍都具有廣泛的前景和深厚的潛力。
漢恒生物所有的敲除單克隆都通過構建T載體進行測序驗證，清晰看出DNA序列的詳細變化，確保敲除性狀穩定不恢復。
CRISPR/Cas 系統全稱為常間回文重復序列叢集/常間回文重復序列叢集關聯蛋白系統(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。這一系統是源於細菌中的一種後天免疫系統（圖1）。該系統可以把侵入細菌的噬菌體遺傳物質整合到自身基因組一個或者多個CRISPR位點作為永久的“記憶”，當細菌被再次入侵的時候，CRISPR 位點被轉錄生成 CRISPR RNAs（crRNAs)。crRNA 隨後會引導 DNA剪切酶 Cas9 根據序列互補的原則剪切入侵的外源核酸序列，消滅外來遺傳物質，發揮保護性能（圖2）。簡而言之，源於 CRISPR/Cas 系統的基因組編輯技藝被工程化為一段介導定位作用的 RNA 序列（guide RNA和crRNA合二為一的雜合RNA序列，稱為sgRNA）加上一個DNA水解酶Cas9組成的二元系統。
研究者把這一系統工程化成可以用於編輯哺乳動物細胞的CRISPR/Cas9系統。詳細包括適於哺乳動物表達的 Cas9 基因和定位作用的 sgRNA（圖3）。方便起見，研究者把這兩者放在了一個載體之中（all in one plasmid）。如果計劃利用這一系統編輯某個目的基因，我們唯一要做的就是定製一條有效的sgRNA。
圖1 CRISPR/Cas 系統來源於細菌的“免疫系統”
圖2 細菌利用 CRISPR/Cas 系統攻擊噬菌體入侵示意圖
圖3 工程化的 CRISPR/Cas 系統。該系統是個二元系統：負責切割的 Cas9 核酸酶和定位用的 guide RNA （sgRNA）
我們一般將感染後經過篩選的細胞稱為穩轉株，也就是混合克隆細胞株。混合克隆細胞株雖然可以表達目的片段，但不同克隆（細胞）的目的基因整合位置和表達量均有所不同。
而單克隆細胞株是從混合克隆細胞中經單個細胞增殖所得，即由同一個細胞擴增得到的細胞株。每個細胞的目的基因整合位置以及表達量等特征均高度一致。
一般情況下，混合克隆穩轉株即可滿足科研需求，比如基因性能初步驗證等實驗，節省了單克隆化的時間與經濟成本。但與單克隆株相比，以此得出的數據穩定性與重復性往往稍差，若想減少實驗的波動，提高實驗的可重復性，則需要挑選單克隆細胞株。
構建基因敲除細胞系時，往往需要挑取單克隆。
實驗室常用的單克隆細胞株挑選方式有三種：
1、有限稀釋法，采用梯度稀釋原則，將細胞懸液連續倍數稀釋至極低密度，接種於96孔板，直至孔中出現單個細胞克隆。
2、平皿克隆分離法，通過在平皿內預置小盖玻片或用金屬套環並加消化液達到分離克隆細胞的目的。
3、軟瓊脂克隆分離法，適用於懸浮細胞。
常見的鑒定方法包括三種：
1，測序鑒定：單克隆直接PCR測序，可以直觀看到編輯位點的DNA序列；
2，酶切鑒定：編輯位點跨過某個內切酶位點的可以用PCR-酶切的方法來判斷；
3，WB鑒定：用抗體直接鑒定目的蛋白是否消失，如果抗體條帶特異，還可以簡化為dot blot。
聯絡我們
返回頂部
6947
