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研究某個基因的性能最常用的手段是在宿主細胞中過表達或者通過RNA幹擾的方法knock-down該基因,常規手段有瞬時轉染和篩選穩定細胞系。
優勢:篩選出該基因的過表達或者RNA幹擾的穩定細胞系會給您的實驗帶來極大的便利。有了穩定細胞系,後期的Co-IP或者Pull-Down實驗會非常便利;穩定表達重組荧光蛋白的細胞系可以讓您變化地觀察分子在細胞中的運動。
原理:構建穩定細胞系的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上,載體被轉染到宿主細胞並整合到宿主染色體中,用載體中所含的抗性標誌進行篩選。最常用的真核表達載體的抗性篩選標誌物有新黴素(neomycin)、潮黴素(hygromycin)和嘌呤黴素(puromycin),常用G418來代替新黴素進行選擇性篩選,篩選得到可穩定表達目的蛋白,或者穩定表達沈默特定基因的細胞株。
穩轉和瞬轉的區別
穩定轉染:即進入細胞的質粒整合入細胞基因組中,並能隨細胞分裂穩定傳遞下去。這是相對瞬時轉染而言的。
瞬時轉染:即外源基因不整合到宿主染色體中,表達時間短暫,絕大部分以遊離形式存在,不能隨細胞分裂而一同復製,導致最後拷貝數被稀釋,無法達到持續表達外源基因的目的。一般用轉染試劑進行質粒轉染,多為瞬時轉染。
一般如下情況需要構建穩定株
1、長期在目的細胞中研究基因性能,通過構建穩定株,可以降低頻繁轉染成本,方便實驗研究;
2、部分蛋白半衰期極長,瞬時RNA只能幹擾表達,無法去除已經表達的目的蛋白,通過構建穩定株可以達成更好的基因幹擾效果;
3、瞬轉往往會引入極高拷貝數的表達,導致因為人為因素造成實驗結果的不精確,構建穩定株可以幫助篩選拷貝數適量的細胞進行實驗研究;
4、需要用誘導表達系統的,主要是一些致死基因或者是需要時空表達的;
5、需要用細胞做動物實驗的,比如裸鼠成瘤等.
質粒構建穩轉細胞系
轉染質粒後,單克隆方法篩選穩定細胞系。但質粒的整合效率低,一般不推選
慢病毒構建穩轉細胞系
慢病毒感染方法較質粒轉染篩選單克隆方法更方便和高效,是目前主流的穩定細胞系篩選方法。
慢病毒幾乎可以感染所有種類的細胞,並且在感染後可以整合到受感染細胞的基因組,進行長時間的穩定表達,因此,慢病毒常用於製備穩定表達/沈默特定基因的單克隆細胞株circRNA /LncRNA過表達和幹擾慢病毒。
漢恒生物構建包裝的帶puromycin抗性的慢病毒,在感染目的細胞後,可通過加入puromycin進行選擇性篩選,從而獲得穩定表達shRNA或者特定基因的細胞株。我們供應慢病毒包裝效勞(您可以自己完成穩態細胞篩選),或者一站式的穩定細胞系的篩選效勞
我們一般將感染後經過篩選的細胞稱為穩轉株,也就是混合克隆細胞株。混合克隆細胞株雖然可以表達目的片段,但不同克隆(細胞)的目的基因整合位置和表達量均有所不同。
而單克隆細胞株是從混合克隆細胞中經單個細胞增殖所得,即由同一個細胞擴增得到的細胞株。每個細胞的目的基因整合位置以及表達量等特征均高度一致。
一般情況下,混合克隆穩轉株即可滿足科研需求,比如基因性能初步驗證等實驗,節省了單克隆化的時間與經濟成本。但與單克隆株相比,以此得出的數據穩定性與重復性往往稍差,若想減少實驗的波動,提高實驗的可重復性,則需要挑選單克隆細胞株。例如細胞亞定位、藥物靶點篩選或者難轉染的細胞,推選構建單克隆的穩定細胞株。
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