Cre/Loxp從原理到應用及相關重組酶系統

前幾期幹貨為大家展現了組織特異性表達調控，其中涉及到了重組酶系統，本期小恒將為大家展現“Cre/Loxp及其相關重組酶系統”。

Cre-LoxP系統是一種重組酶系統，能在DNA特定位點上執行删除、插入、易位及倒位，是一種廣泛應用的基因編輯工具，可以達到在基因水平上對生物體進行定向遺傳改造的目的，在真核和原核系統中均適用。

Cre（Cyclization Recombination Enzyme）是一種重組酶，1981年從P1噬菌體中發現，基因編碼區序列全長1029bp，編碼由343個氨基酸組成的38kDa單體蛋白。Cre重組酶不僅具有催化活性，而且與限製酶相似，能識別特異的DNA序列，即Loxp位點，介導Loxp位點間的基因序列删除或重組。

LoxP（locus of X-over P1）來源於噬菌體P1，是一段長度為34bp的DNA序列，由兩個13bp的反向重復序列和一個不對稱的8bp間隔區共同組成。反向重復序列是Cre重組酶的特異識別和結合區域，而間隔區域決定了LoxP位點的方向。

其序列如下：（N 表示堿基可能發生變化）

圖1 Cre-LoxP基本作用原理

一、Cre-LoxP系統基本作用方式

一般而言，當細胞基因組內存在兩個LoxP位點時，Cre重組酶會誘導兩個LoxP位點間的序列發生重組。重組的結果取決於兩個LoxP位點的方向，主要有以下幾種可能：

1、如果兩個LoxP位點位於一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導致兩個LoxP位點間的序列翻轉；

2、如果兩個LoxP位點位於一條DNA鏈上，並且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列；

3、如果兩個LoxP位點分別位於兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導兩條DNA鏈的交換或染色體易位；

4、如果四個LoxP位點分別位於兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶能誘導LoxP間的序列互換。

圖2 Cre-LoxP誘導基因重組的方式

二、Cre-LoxP條件性重組改造

經過現代基因工程方法對Cre和LoxP元件的改造，Cre-LoxP系統達成了更加豐富的條件性重組策略。

1、Cre元件改造

在Cre元件的C端接上一段改造過的配體結合結構域LBD，新的融合蛋白Cre-LBD將定位在胞漿內，當人工合成的激素分子結合到Cre-LBD受體後，蛋白構象改變並進入核內，介導基因重組，目前使用最多的是Tamoxifen誘導的CreERT2突變體，它的LBD來自於雌激素受體ER分子，當有Tmoxifen的時候，Cre才能介導基因重組，這樣通過控製Tamoxifen的註射時間，可以達成對基因重組時間特異性的調控。

圖3 Tamoxifen誘導的Cre-ER系統

2、Loxp元件的改造

LoxP元件也有一些突變體，間隔區和回文序列都可以進行突變，突變後的序列依然能被Cre重組酶識別和重組，但是突變的LoxP序列必須和同樣突變的LoxP序列匹配介導基因重組，而不能和未突變的LoxP序列匹配，這樣將不同的LoxP序列組合用於控製多個基因（DIO/DO系統中的Lox2272位點），在同一Cre重組酶的作用下，可以達成多序列的基因重組，產生非常多元的重組結果。

DIO/DO序列

通過引入兩對不同的LoxP位點—LoxP和Lox2272，經過兩組Lox位點的兩輪重組可達到一種穩定狀態。也就是可以通過Cre重組酶的存在與否來控製基因的表達。

在這種策略下，任一對 Lox 位點間的序列會在 Cre 的作用下發生可逆的快速翻轉，之後 Cre 重組酶馬上不可逆地切割翻轉後的同向 Lox 位點，只留下翻轉後的基因和單獨的 LoxP、Lox2272 位點，防止基因的再次翻轉。基於上述原理，可以在病毒載體中構建 DIO 和反向基因，感染 Cre 陽性細胞後，可以讓Cre陽性的細胞表達基因，稱為DIO（Cre-on） 結構；如果預先包裝的基因是正向，那麽 Cre 陽性的細胞則不表達基因，其余細胞表達基因，稱為DO（Cre-off）結構。

圖4 借助LoxP和Lox2272的DIO/DO策略達成Cre依賴的基因表達

三、其他重組酶系統展現

重組酶系統除了經典的Cre-Loxp系統外，還有與Cre-Loxp系統無交叉影響的vCre-vLoxP、sCre-sLoxP 系統、Flp/Flpo-FRT系統、Dre-Rox 系統和Vika-vox系統。

1、vCre/sCre系統

vCre/sCre均為Cre重組酶的同源蛋白，但與Cre的同源性很低，可以特異性識別vLoxp/sLoxp位點。

2、Flp-FRT系統

Flp（Flippase recombination enzyme）重組酶，從酵母細胞內被發現，其基因全長1272bp，為48kDa大小的、由423個氨基酸組成的多肽單體蛋白。FRT是Flp的識別位點，全長48bp，包含3個13 bp的重組酶結合區和1個8 bp的含Xba I位點的非對稱間隔區（spacer）。Flp-FRT 系統與 Cre-LoxP 誘導基因重組的方式類似，兩系統明顯的區別是重組酶（Cre 和 Flp）具有不同的最佳反應溫度，有研究發現，Cre 重組酶的最佳溫度為 37℃，而 Flp 重組酶為 30℃。研究人員後續構建了Flpo—Flp突變體，在37℃也可以表現出較好的耐熱性。

圖5 Cre\Flp\Dre 系統比較

3、Dre-Rox系統

Dre重組酶來源於D6噬菌體，能特異性地識別一段長度為32bp的DNA序列（Rox位點）並介導該序列間的DNA發生重組。因其重組效率高且不會與Cre重組酶發生交叉反應，二者常聯合使用以達成更加精細的基因操作。

4、Vika-vox系統

Vika重組酶來源於珊瑚弧菌，基因全長1086bp，能特異性地識別一段長度為34bp的DNA序列（vox位點）並介導該序列間的DNA發生重組。該系統與Cre/Loxp和Flp/FRT系統相比，具有細胞毒性低，使用範圍廣和安全性高等優勢。

圖6 Vika 及 Cre結構模型

四、漢恒重組酶病毒現貨列表

五、Cre-Loxp系統的應用實例

1、依賴Cre的條件性基因表達

文章利用AAV血清型和特異性啟動子結合Cre-Loxp系統在Cre小鼠特定組織達成目的基因的表達；如：將AAV5-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry通過腦立體定位註射到Vglut3-Cre小鼠腦DRN區，結合化學遺傳達成DRN區神經元細胞的激活。

圖7 依賴Cre介導的基因條件性表達

2、依賴Cre的條件性基因敲除

文章利用AD介導的Cre-Loxp系統可以對特定組織達成目的基因的快速敲除。如：利用AD載體攜帶Cre酶基因，註射到PINCH-1flfl和KrasLSL-G12D/+(Krasflfl/+)工具鼠註入肺誘導KrasG12D的表達和PINCH-1基因的失活。PINCH-1敲除顯著降低了細胞增殖，KrasLSL-G12D/+小鼠表達KrasG12D顯著誘導肺腫瘤形成。

圖8 依賴Cre介導的特定組織基因敲除

3、依賴cre的條件性基因敲低

文章利用AAV-shRNA通過腦立體定位註射Crh-IRES-Cre小鼠PVN區，在PVN區達成PSD-93基因的敲低。

圖9 依賴Cre介導的特定組織基因敲低

六、Cre-LoxP系統的優點

Cre-LoxP系統是目前在神經系統中應用最廣泛的條件性基因敲除工具，主要是因為該系統有如下優點：

1、高效性：Cre重組酶與具有LoxP位點的DNA片段形成復合物之後，可以供應足夠的能力引發之後的DNA重組過程，重組過程簡約高效；

2、特異性強：LoxP位點是一段含回文序列結構和中間有間隔的34bp元件，這種結構保證了LoxP序列的唯一性，從而保證基因重組的特異性很強；

3、應用範圍廣：Cre重組酶是一種比較穩定的蛋白質，可以在生物體不同的組織、不同的生理條件下發揮作用；

4、II型啟動子啟動表達：Cre重組酶的編碼基因可由任何一種II型啟動子驅動，由此保證Cre重組酶在生物體不同的細胞、組織、器官或者在不同的發育階段或不同的勝利條件下表達，從而達成較高的組織和細胞特異性。

至此，本期內容就結束了，主要展現了“Cre/Loxp及其相關重組酶系統”，下期我們將分享心血管系統特異性表達調控，敬請期待。

參考文獻：

[1] Kim, H., Yonsei University College of Medicine, Seoul, Kim, M., Yonsei University College of Medicine, Seoul, Im, S.K., Yonsei University College of Medicine, Seoul, et al. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes[J]. Laboratory Animal Research, 2018.

[2] Schneeberger M, Brice NL, Pellegrino K, Parolari L, Shaked JT, Page KJ, Marchildon F, Barrows DW, Carroll TS, Topilko T, Mulligan VM, Newman R, Doyle K, Bürli R, Barker DF, Glen A, Ortuño MJ, Nectow AR, Renier N, Cohen P, Carlton M, Heintz N, Friedman JM. Pharmacological targeting of glutamatergic neurons within the brainstem for weight reduction. Nat Metab. 2022 Nov;4(11):1495-1513.

[3] Ling G , Cui C . PINCH-1 regulates mitochondrial dynamics to promote proline synthesis and tumor growth[J]. Nature Communications, 2020, 11(1):4913.

[4] Qin XY, Shan QH, Fang H, Wang Y, Chen P, Xiong ZQ, Swaab DF, Zhou JN. PSD-93 up-regulates the synaptic activity of corticotropin-releasing hormone neurons in the paraventricular nucleus in depression. Acta Neuropathol. 2021 Dec;142(6):1045-1064.

[5] Fenno L E , Mattis J , Ramakrishnan C , et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic[J]. NATURE METHODS, 2014, 11(7):763-772.

[6] Madina K ,  Josephine A G ,  Nicolas B , et al. Vika/vox, a novel efficient and specific Cre/loxP-like site-specific recombination system[J]. Nucleic Acids Research(2):e37-e37.