細胞凋亡系列篇【3】Caspase家族基因

在細胞凋亡系列幹貨的前期內容中我們展現了細胞凋亡的概述及相關的MAPK家族基因，今天我們繼續展現細胞凋亡相關的Caspase家族基因。本期內容我們主要從Caspase家族基因成員及結構、Caspase家族基因的組裝與活化和Caspase家族基因與細胞凋亡的關系等三大方面分享Caspase家族基因的故事。

一、Caspase家族成員及結構

半胱天冬酶是一個進化保守的半胱氨酸依賴性內切蛋白酶家族，半胱天冬酶對底物具有高度的特異性，在特定的天冬氨酸殘基後水解其底物，積極參與細胞凋亡的執行[1]。迄今為止，已鑒定出14種哺乳動物半胱天冬酶，通常根據其在細胞凋亡和炎癥中的性能進行類別，或者根據它們對底物的切割識別序列進行類別[2]。根據性能和結構域結構，Caspase家族的成員主要被分為炎癥型或凋亡型。

1. Caspase -1、-4、-5和-11被歸類為炎性Caspase，在結構上，包含一個大小可變的氨基末端結構域，在N端共享一個Caspase激活和募集結構域（CARD），隨後是分別約20 kDa和10 kDa大小的催化亞基（α大亞基和β小亞基），它們共同形成蛋白酶結構域。

2. 凋亡型Caspase可進一步分為啟動型Caspase和執行型Caspase。凋亡啟動型Caspase在長前結構域前還含有CARD或死亡效應結構域（DED），Caspase -8、-9和-10被歸類為啟動型Caspase。與凋亡啟動型Caspase不同，凋亡執行型Caspase是缺乏CARD或DED結構域的短的長前結構域和短催化結構域組成，Caspase -3、-6和-7被歸類為執行型Caspase。

3. 此外，Caspase-2、-12與炎性Caspase具有相同的結構域結構，Caspase-2性能被描述為與細胞周期相關。而小鼠Caspase-12的性能仍然不明確，對於人類Caspase-12，普遍認為75%的Caspase-12基因被敲除，而其余25%的Caspase-12基因攜帶一種不具有蛋白水解活性的假蛋白酶。Caspase-14的結構只有大小催化亞基，它的性能與細胞分化有關。

圖1. Caspase家族成員及結構域示意圖[1]

二、Caspase的組裝與活化

Caspase活化是一個有序的多步驟水解過程，主要分為兩種方式：同源活化和異源活化。同源活化通常是通過適配器的募集，促使啟動Caspase形成同源二聚體並被激活，進而啟動細胞死亡程序，因此，同源活化是細胞凋亡早期的關鍵事件。而異源活化相對復雜，需要一種Caspase激活另一種Caspase。如執行Caspase不具備募集能力，必須依賴於啟動Caspase的活化才能被激活，通過這種方式放大凋亡信號並完成細胞凋亡過程的執行[3]。

Caspase的組裝與活化過程‌：

1.‌前體形式存在‌：Caspase通常以非活性酶原的形式存在，即前體形式。N端前肽在Caspase前體的N端與大亞基之間的特定部位被水解去除，接着切割大小亞基釋放，這些前體由兩個大亞基和兩個小亞基組成，形成異源四聚體。Caspase家族基因的切割和催化位點見圖3[4]。

2.‌剪切激活‌：許多Caspase以非活性的前體形式存在，需要特定的刺激或與其他分子相互作用進行剪切才能激活。在細胞凋亡過程中，啟動Caspase可以通過與適配器蛋白等相互作用，形成多蛋白復合物，進而激活啟動Caspase。Caspase酶原自動激活為活性蛋白酶的過程是由二聚化誘導的構象變化驅動的，這些構象變化導致分離前結構域和大小催化亞基的柔性接頭區域被蛋白水解切除。

Caspase-8可以直接被死亡受體（如Fas或TNF-R1）激活，死亡受體與它們的配體（如Fas配體或TNF）結合時，Caspase-8會被招募到細胞膜上形成復合物，稱為死亡誘導信號復合物（DISC，Death-Inducing Signaling Complex）。在這個復合物的形成過程中，Caspase-8會發生聚集和激活[5]。

Caspase-9的活化可以由多種信號通路介導，其中最為典型的是線粒體途徑。在該途徑中，細胞色素C與Apaf-1（apoptotic protease activating factor-1）和ATP結合，形成復合物，進而活化Caspase-9[5]。‌‌

3.‌級聯反應‌：在細胞凋亡途徑中，Caspase-3、-6和-7的激活通常是通過級聯反應而達成的，啟動Caspase（如Caspase-9）或信號轉導路徑的其他分子被激活後，它們會活化Caspase-3和Caspase-7，形成一個放大信號的級聯反應，這種機製確保了細胞凋亡是一個不可逆的過程。

Caspase-3的性能形式（即四聚體結構）具有兩個相同的活性位點。每個活性位點都包含一個保守的催化組氨酸-半胱氨酸基序，該基序可以在天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸（D - e - v - D）四肽基序中特異性地切割天冬氨酸殘基後的底物[3]。

圖2. Caspase的活化與成熟[3]

圖3. Caspase的催化和激活裂解位點示意圖[4]（突出大箭頭：激活裂解的位點，中、小箭頭：其他裂解的位點，L1-L4：形成催化槽的四個表面環，催化殘基Cys在L2的起始處用紅線表示。）

三、Caspase家族基因與細胞凋亡的關系

在生理環境中，內在的遺傳程序允許真核細胞以一種受調節的方式經歷細胞死亡，通常被稱為細胞程序性死亡。細胞凋亡是細胞程序性死亡的經典形式，被認為是一個穩態的非炎癥過程，它在不驚動免疫系統的情況下清除受損、感染和老化的細胞[1]。

Caspase作為高度保守的細胞內蛋白酶，能夠在天冬氨酸殘基後的肽鍵處切割目標蛋白，從而促進程序性細胞死亡。促凋亡刺激誘導細胞啟動Caspase級聯，導致啟動Caspase的鄰近誘導激活。這反過來又通過蛋白水解激活效應Caspase，促進細胞組分的系統性分解，導致特征性的細胞內變化，包括DNA降解、核收縮和斷裂、膜泡和凋亡小體的釋放，並最終導致細胞凋亡和吞噬作用清除死細胞。不同的上遊信號事件，如死亡受體DR參與（外源性）或細胞應激（內在），會導致不同的死亡誘導凋亡機製。因此，基於啟動模式和參與該過程的特定適配器和啟動Caspase，凋亡途徑通常可分為外源性或內源性細胞凋亡途徑[6]。

1、外源性凋亡途徑

外源性凋亡途徑是細胞外配體誘導的DR信號傳導的核心，該途徑通過死亡配體與死亡受體的結合而被激活。表征良好的DR家族成員包括腫瘤壞死因子超家族成員TNF受體1 （TNFR1）、凋亡抗原1 （APO-1、Fas）、TNF相關凋亡誘導配體受體1（TRAIL-R1）和TNF相關凋亡誘導配體受體2（TRAIL-R2）。Fas、TRAIL-R1和TRAIL-R2與它們的同源配體結合導致受體寡聚化並募集靶細胞中的下遊接頭Fas相關死亡結構域（FADD）或TNFR1相關死亡結構域（TRADD）蛋白、Caspase-8酶原等蛋白質形成復合物DISC。隨後在細胞膜上組裝的復合物DISC中的Caspase-8酶原的寡聚化和激活，引起執行細胞凋亡的關鍵酶Caspase-3的蛋白質水解酶級聯反應，最終導致細胞死亡[6]。

圖4. 細胞凋亡過程中的Caspase家族基因性能[6]

2、內源性凋亡途徑

當線粒體完整性在應激反應中受損時，就會觸發內在凋亡途徑。在生長因子剝奪、DNA損傷或癌基因激活的反應中，僅含Bcl-2同源區3（BH3）結構域的蛋白被轉錄或轉錄後誘導，BH3-only蛋白結合並抑製抗凋亡Bcl-2蛋白，這導致細胞死亡效應器BAX和BAK（Bcl-2家族促凋亡蛋白成員）的釋放和激活，然後寡聚並促進線粒體外膜通透性（MOMP），從而釋放包括細胞色素C和Smac/Diablo蛋白在內的凋亡因子到細胞質中，細胞色素C結合Apaf-1的WD結構域，Apaf-1同時與ATP發生結合，這導致Apaf-1的寡聚化（多為7聚化）和構象改變暴露出N端的Caspase募集結構域，Apaf-1又與Caspase-9酶原發生結合，將其裝配到凋亡體蛋白復合物中。在凋亡體中，Caspase-9酶原發生寡聚化和自我激活啟動Caspase級聯反應，驅動Caspase-3/-6/-7導致細胞凋亡的穩健執行[6-7]。

凋亡執行Caspase-3/-6/-7的酶原是無活性的同型二聚體，當被激活時，會切割和活化數百種細胞蛋白，包括結構蛋白和DNA修復蛋白等，最終導致特征性形態變化。其中底物多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）、DNA 依賴性蛋白激酶（DNA-PK）參與DNA修復，一旦被Caspase裂解而失活，DNA降解就會隨之而來。Caspase激活脫氧核糖核酸酶（CAD）是一種可被Caspase激活的鎂依賴性內切酶。在細胞凋亡中，Caspase-9破壞核孔，使Caspase-3能夠進入細胞核切割CAD特異性抑製劑（ICAD），將CAD從CAD-ICAD復合物中釋放出來，從而導致DNA降解。核纖層蛋白A（Lamin A）和胞襯蛋白（Fodrin）分別是核骨架和細胞質骨架的重要組成部分。細胞凋亡過程中Caspase對Lamin的裂解可導致染色質的凝聚和核膜的分解，對Fodrin的裂解可導致凋亡小體的形成。當各種Caspase底物被激活時，可引發多個細胞凋亡的典型特征，例如DNA損傷修復能力下降、細胞骨架解體、染色質斷裂、細胞核碎裂、細胞質收縮和細胞膜破裂等細胞凋亡狀況[8]。

圖5. 凋亡執行子半胱天冬酶的下遊底物[8]

3、外源性和內源性凋亡途徑之間存在密切聯絡

死亡受體誘導的凋亡途徑可以通過蛋白水解與內在凋亡途徑連接，主要通過Caspase-8激活的BCL-2同源3相互作用結構域死亡激動劑（BID）蛋白切割，產生tBID，tBID進入線粒體作用於促凋亡BAX-BAK分子開關，促進細胞色素C的釋放，進而激活MOMP和內源性凋亡途徑[6-7]。

圖6. 細胞凋亡和壞死下垂的分子途徑[7]

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參考文獻：

[1]Van Opdenbosch N, Lamkanfi M. Caspases in Cell Death, Inflammation, and Disease. Immunity. 2019 Jun 18;50(6):1352-1364. doi: 10.1016/j.immuni.2019.05.020. PMID: 31216460; PMCID: PMC6611727.

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[4]Shi Y. Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. Mol Cell. 2002 Mar;9(3):459-70. doi: 10.1016/s1097-2765(02)00482-3. PMID: 11931755.

[5]McIlwain DR, Berger T, Mak TW. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015 Apr 1;7(4):a026716. doi: 10.1101/cshperspect.a026716. Erratum for: Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013 Apr 01;5(4):a008656. doi: 10.1101/cshperspect.a008656. PMID: 25833847; PMCID: PMC4382736.

[6]Kesavardhana S, Malireddi RKS, Kanneganti TD. Caspases in Cell Death, Inflammation, and Pyroptosis. Annu Rev Immunol. 2020 Apr 26;38:567-595. doi: 10.1146/annurev-immunol-073119-095439. Epub 2020 Feb 4. PMID: 32017655; PMCID: PMC7190443.

[7]Moujalled D, Strasser A, Liddell JR. Molecular mechanisms of cell death in neurological diseases. Cell Death Differ. 2021 Jul;28(7):2029-2044. doi: 10.1038/s41418-021-00814-y. Epub 2021 Jun 7. PMID: 34099897; PMCID: PMC8257776.

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