病毒選擇指南 & FAQ

Q1、慢病毒載體和腺病毒載體，該怎麽選？

答：不管是慢病毒載體還是腺病毒載體，都是很好的基因調控工具，各自有自己的優勢，主要根據實驗目的不同來選擇，可以參考以下幾個方面來判斷：

（1） 插入目的序列的大小：慢病毒載體包裝容量在2kb以內可以保證滴度，腺病毒包裝容量在5kb以內可以保證滴度；若目的序列大小超過載體容量，滴度則會隨着目的序列大小增加而降低；

（2） 是否需要構建穩轉細胞株：慢病毒載體可以將外源基因隨機整合到目的細胞基因組中並穩定遺傳，即可用於構建穩轉細胞株，當然做瞬時轉染也可以；而腺病毒不整合基因組，只適用於瞬時轉染；

（3） 目的細胞類型：像神經細胞、一些原代細胞等感染難度比較大的細胞，且後續無需建立穩轉株，推選使用腺病毒，其感染效率要遠高於慢病毒。

Q2：收到病毒後如何保存？

答：收到病毒液後若在短期內使用，可將病毒放置於4 ℃保存，並最好在一周內使用完；如需長期保存，可按需分裝好放置於-80 ℃，以避免使用過程中反復凍融；如要置於液氮罐保存則需更換專門的保存管。另外，若病毒儲存時間超過6個月，漢恒生物建議在使用前重新測定病毒滴度。

Q3：病毒使用過程中如何進行稀釋？

答：需要稀釋病毒時，請將病毒取出置於冰浴融解後，使用PBS或培養目的細胞用的無血清培養基（含血清或含雙抗不影響病毒感染）混勻分裝後置於 4 ℃保存（一周內使用完最佳）。以慢病毒為例：如原病毒標記的滴度為1x10⁸ TU/mL，取10 μL至90 μL到常規培養基中，即可得到1x10⁷ TU/mL滴度的病毒。

Q4：什麽是MOI？

答：MOI，感染復數，是指病毒對細胞的感染能力，細胞需要的MOI值越高，證明細胞越難被感染。通常把某株細胞80%被感染時所需要的病毒顆粒數與細胞數目的比值作為該株細胞的MOI值。

相關計算公式：

每孔加病毒量（μL）=MOI × 細胞數 / 病毒滴度（TU/mL或PFU/mL）×1000

MOI=（病毒滴度 × 病毒體積）/ 細胞數

Q5：用於病毒感染的細胞接種量是多少？

答：根據細胞大小和增殖的速度調整細胞接種量，以保證在感染後2~3天細胞剛好快長滿培養皿底部為宜。針對大部分細胞系：傳代周期在2-3天，感染時細胞鋪板的密度保持在30-50%左右，則細胞增殖48 h後細胞匯合度約在90%左右；針對某些原代細胞：由於細胞增長緩慢，可以在接種時提高匯合度到50-60%左右，但要確保在感染後2天細胞匯合度達到90-100%；針對非分裂細胞：如神經元細胞，接種後不再增殖，此時可以按照100%的匯合度進行接種。

Q6：如何確定向細胞中加入病毒的最佳時間？

答：慢病毒感染細胞後需要48-72 h觀察到病毒攜帶的基因表達，腺病毒感染細胞後需要36-48 h觀察到病毒攜帶的基因表達，應在細胞匯合度30-50%且細胞狀態良好時加入病毒。

Q7：對照病毒或目的病毒感染細胞以後，細胞形態發生改變或者細胞死亡？

答：首先，確定細胞或病毒是否有汙染；其次，確定病毒感染MOI值是否過高，調整MOI值，並在感染後的4 h、8 h和12 h對細胞進行觀察，若發現細胞狀態變差時，則需要使用新鮮的完全培養液替換病毒感染培養液；排除以上因素後細胞狀態仍然不好，嘗試增加血清含量，觀察細胞狀態是否好轉。

Q8：如何提高病毒對細胞的感染效率？

答：病毒對細胞的感染效率受多個因素影響，如病毒活性、細胞自身的狀態、MOI值、感染時間等。

①病毒活性：解凍病毒一定要在冰上進行，盡量避免反復凍融。-80 ℃保存半年以上需要重新測滴度。

②目的細胞：先進行預實驗測試，看病毒載體是否合適感染目的細胞。對於懸浮細胞，可采用平角離心感染的方法，減少病毒感染時的體積，從而提升感染的效率。

③MOI值：進行MOI梯度摸索實驗，找出最優的MOI值。

④感染時間：太早換液會導致感染效率下降；換液太晚，則對細胞的損傷較大。若細胞狀態比較好，可適當延長換液時間來進一步提高感染效率。

⑤助轉劑：可根據情況添加一定濃度的polybrene，不同細胞對polybrene的敏感性不同，可以用1-10 μg/mL 的範圍篩選合適濃度，以24 h內細胞無明顯毒性反應為佳。

Q9：哪些實驗可以選擇AAV病毒？

答：AAV病毒時高效的體內基因遞送工具，適用於動物體內實驗，但因為其容量和表達特性，對於基因較大或者需要感染後快速表達的實驗不適合使用AAV，其余情況一般都適用。

Q10：AAV病毒應該如何稀釋保存？

答：收到病毒液後若在短期內使用，可將病毒放置於4 ℃保存，並最好在一周內使用完；如需長期保存，可按需分裝好放置於-80 ℃，以避免使用過程中反復凍融；如要置於液氮罐保存則需更換專門的保存管。使用過程中如果需要稀釋則使用PBS或生理鹽水按需進行稀釋使用。

Q11：AAV註射小鼠，多少病毒量才夠呢？

答：影響AAV註射總量的因素很多，比較重要的有血清型、目標組織類型、註射方式（局部or全身）、動物模型（如大鼠or小鼠）等，對於有文獻報道的，可參考文獻的註射方法，最好設置幾個不同的梯度。例如AAV9感染小鼠心臟組織（心肌細胞），可采用尾靜脈註射也可采用心肌多點註射的方式，尾靜脈註射推選10¹¹ vg/mL，100μL；原點註射則推選10¹² vg/mL，20 μL。

Q12：AAV可以通過哪些方法註射到動物體內進行感染？

答：根據實驗感染的詳細需求，可以分為系統性給藥和局部給藥。系統性給藥如尾靜脈註射，通過血液循環將病毒顆粒遞送到全身各處,但這種方法對肝臟感染效果很好，而對其他一些組織和臟器效果欠佳，特別是對腦組織，因為血腦屏障的原因，需要和特異性血清型配合才能通過尾靜脈註射達成腦組織感染；二是局部給藥，如腦立體定位註射、肌肉註射等這種註射方法可以比較高效地感染局部組織，特異性好，病毒用量也小，但對於一些組織器官的註射需要進行手術或者需要特殊設備，操作難度較大。

Q13：AAV註射動物後多久可以觀察病毒感染效果？

答：AAV是單鏈的DNA病毒，感染到細胞內需要先形成雙鏈形式的附加體才能進行基因表達。在1-2周時目的序列也在表達，但此時處於表達逐漸積累階段，表達量好較低，所以，一般建議3-4周後檢測目的基因表達情況比較穩妥。

Q14：AAV註射後如何檢測目的基因過表達？

答：AAV病毒註射3-4周後開始檢測，過表達可以通過免疫組化、免疫荧光和wb在蛋白水平上檢測，但通常對所使用的抗體要求比較高，為了方便檢測，可以在構建過表達載體時在蛋白上融合一個flag表圈，檢測時直接通過商業化的flag抗體檢測進行檢測，也可以通過qpcr直接檢測轉錄水平的變化；對於基因幹擾的檢測，一般只通過qpcr檢測轉錄水平的下調情況。

Q15：用AAV可以達成組織特異性的感染嗎？

答：可以。通過AAV定點註射、特異性血清型可以達成組織特異性的感染，結合特異性啟動子，更可以細到特定細胞的特異性表達調控。