荧光素酶報告基因檢測效勞

pGL3-Basic---用於轉錄因子結合位點與啟動子活性分析。把待分析啟動子區段構建到F-Luciferase上遊，和轉錄因子共轉染分析F-Luciferase活性即可反應啟動子的活性高低。該質粒通常需要結合持續性表達R-Luciferase的載體作為內參以校正不同樣品之間轉染的轉染效率(參考實例一)。

psiCHECK2---miRNA與其靶點相關分析,包括miRNA靶基因驗證(參考實例二A和B)、lncRNA (參考實例三)與circRNA (參考實例四)吸附miRNA驗證等。需要把miRNA潛在結合靶點克隆到R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR區域，然後與待測miRNA共同轉染細胞內測定R-Luciferase活性高低，F-Luciferase （hLuc+）作為校正內參校正不同樣品之間轉染的轉染效率。

LncRNA轉錄因子結合位點與啟動子活性分析

論文來源: Wang, P., et al. (2014). "The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation." Science 344(6181): 310-313.

本文是曹雪濤實驗室在2014年發表在Science上一篇研究性論文。作者通過芯片鑒定出DC (樹突狀細胞)發育相關的一個lncRNA，命名為lnc-DC。同時高通量測序也發現了這條差異lncRNA的存在。進而作者通過Northern Blot驗證了這條lnc-DC。由於lnc-DC極其特異和穩定地高表達在DC發育過程的某一時期，所以作者假設lnc-DC可能是和表觀遺傳學調控事件相關的。為了驗證這一假設，作者通過染色體免疫沈澱結合測序的技藝-CHIP-seq和qPCR發現lnc-DC的轉錄起始位點（TSS）附近富集了Pol II、H3K4me3和H3K27ac等蛋白（下圖A），提示DC發育過程中表觀遺傳學變化與lnc-DC的轉錄增強事件相對應。進而作者通過序列分析發現在lnc-DC的轉錄起始位點附近（+44-+50）存在一個經典的PU.1結合位點。作者假設PU.1參與了lnc-DC的特異性表達。於是作者策劃了如下實驗進行了進一步的驗證（下圖B）。

作者把lnc-DC的啟動子區段（-1447-+223）及其不同的突變體版本分別克隆到F-Luciferase表達框上遊，然後和轉錄因子PU.1表達質粒或者空載體（Vector）共同轉染到模式細胞系HEK-293T，通過測量荧光強度的變化間接反應轉錄活性的高低。最終證明轉錄因子PU.1通過經典結合位點（+44-+50）介導了lnc-DC在DC發育過程中的特異表達。

LncRNA通過吸附miRNA調控靶基因mRNA的表達 (ceRNA)

論文來源: Cesana, M., et al. (2011). "A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA." Cell 147(2): 358-369.

作者通過表達分析發現了一條肌肉發育相關的lncRNA---lnc-MD1.前期性能研究發現lnc-MD1可以調控肌肉分化的時間。信息學分析發現這條肌肉特異的lncRNA上包含36個miRNA的結合位點。如果只考慮肌肉發育相關的miRNA和基因，36個候選miRNA裏面只剩下miR-133和miR-135。作者通過荧光素酶實驗進行了驗證。首先作者把野生型及其缺失miR-133和miR-135結合位點的Lnc-DC1克隆到進R-Luc的3’UTR，然後分別與表達miR-133和miR-135前體的質粒共同轉染到細胞進行荧光素酶活性檢測（下圖A和B）。證明lnc-MD1缺失存在miR-133和miR-135的結合位點。

進一步的信息學預測，miR-133和miR-135分別靶向兩個基因- MAML1 和 MEF2C。同樣，作者還是通過荧光素酶實驗進行驗證。研究者把MAML1 和 MEF2C的3’UTR （WT）和miRNA結合位點缺失突變體（-mut）分別克隆在RLuc表達框的下遊，然後和miRNA過表達載體共轉染細胞進行酶活測定。結果顯示miR-133和miR-135確實分別靶向了MAML1 和 MEF2C兩個基因（下圖C）。最後的模型是lnc-MD1通過ceRNA機製吸附miR-133和135，正向調控了MAML1 和 MEF2C的表達，參與調控肌肉發育。

LncRNA通過吸附miRNA調控其生理性能 (ceRNA)

論文來源: Kallen, A. N., et al. (2013). "The imprinted H19 lncRNA antagonizes let-7 microRNAs." Molecular Cell 52(1): 101-112.

H19屬於非常保守的印記基因家族，在胚胎發育和生長方面發揮極其重要的性能。為了進一步研究lncRNA H19的性能，作者通過信息學分析發現H19包含let-7的4個結合位點。於是作者推測H19可能會影響let-7發揮作用。

為了驗證這一預測，研究者把4個let-7潛在結合位點串聯起來克隆到RLuc的3’UTR區。然後先後跟let-7的抑製型載體（下圖A和C）和過表達載體（下圖B）分別共轉染到細胞系檢測荧光素酶的活性，證明Let-7的結合位點確實存在且發揮性能。進一步證明H19通過RNA sponge的機製影響let-7家族靶基因的表達參與肌肉發育調控過程。

circRNA通過吸附miRNA調控其生理性能 (ceRNA)

論文來源: Zheng, Q., et al. (2016). "Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs." Nat Commun 7: 11215.

環狀RNA (circRNA)是非編碼RNA範圍一類新的明星分子，研究者對其性能還知之甚少。

本文中，作者鑒定出一個表達量較高的環狀RNA分子-circHIPK3. circHIPK3來源於基因HIPK3第二個外顯子。RNAi幹擾circHIPK3可以影響細胞的生長。為了進一步研究其機製，作者通過序列分析發現circHIPK3含有一些列miRNA結合位點。為了從中篩選出真正的miRNA，作者構建了基於荧光素酶的篩選系統---把circHIPK3構建到Luciferase的3’UTR區域，然後分別與424個miRNA mimics共轉染到模式細胞系HEK-293T內進行篩選驗證，最終作者篩選出9個候選的miRNA。通過性能試驗和共表達分析進一步驗證得到mir-124是陽性候選miRNA。最終作者證明circHIPK3通過吸附miR-124正向調控了其靶基因IL6R 和 DLX2的表達，影響了細胞的生長。