荧光素酶幹貨系列三：應用篇-轉錄因子與啟動子互作驗證

荧光素酶作為一種理想的報告基因，被廣泛應用於轉錄因子結合位點與啟動子活性分析、RNA降解、信號轉導、藥物篩選、動物活體成像等範圍。前兩期為大家展現了荧光素酶的擴展和原理以及在miRNA與靶基因結合方面的應用。本期就來詳細聊聊雙荧光素酶在轉錄因子與啟動子互作驗證方面的應用。

真核生物基因表達是一個十分復雜而有序的過程，是眾多的反式因子和順式作用元件之間相互作用的結果。基因的表達在各個層次上都受到精密的調控（包括染色體結構、轉錄、轉錄後、翻譯和翻譯後加工等水平的調控）。轉錄水平的調控發生在基因表達的初期階段，是很多基因表達調控的主要方式之一，該過程是指一類稱為轉錄因子的蛋白質特異地結合到靶基因調控區的順式作用元件上，或調節基因表達的強度，或控製靶基因的時空特異性表達，或應答外界刺激和環境脅迫，最終呈現生物體不同的表征，對生命的正常發育和進化至關重要。

圖1. 基因轉錄機製示意圖

作為基因表達調控的開關，啟動子是一段控製基因表達的DNA序列，由許多元件組成，能夠與轉錄因子結合並在調控基因表達中起着關鍵作用。最重要的元件是TATA盒（一段6-8堿基序列），它是轉錄因子結合的關鍵信號點。此外，還有CAAT盒、GC盒和增強子等元件，它們也具有重要的調控性能。這些元件的排列組合和序列多樣性導致基因啟動子在不同類型細胞中具有不同的調控特征。

圖2. 啟動子關鍵元件

了解啟動子、增強子及轉錄因子等轉錄調控元件對目標基因表達的影響在研究基因性能、信號通路相關調控網絡、調控機製等方面都有着非凡意義，而雙荧光素酶在這方面的應用已經十分成熟。下面為大家詳解一下利用雙荧光素酶報告系統進行轉錄調控元件活性及結合位點預測等實驗策劃思路與細節。

一、目的基因啟動子序列獲取及與轉錄因子的結合位點預測

在線網站UCSC（http://www.genome.ucsc.edu/）或NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）均可獲取指定基因的啟動子序列；結合位點可通過在線網站JASPAR （https://jaspar.genereg.net/）進行預測。詳細方法可關註“小恒學術”視頻號，觀看往期相關視頻。常用增強子查詢數據庫：EnhancerAtlas（http://www.enhanceratlas.org/）、dbSUPER（https://asntech.org/dbsuper/）等。

二、雙荧光素酶驗證系統相應質粒體系及分組

漢恒出品用於啟動子活性及與轉錄因子結合驗證的雙荧光素酶報告系統：pGL3-Basic，將待分析啟動子元件序列構建到F-Luciferase上遊；pcDNA3.1，用於過表達待測轉錄因子。用於增強子/抑製子研究的雙荧光素酶報告系統包括：pGL3-Promoter，將待分析增強子/抑製子序列構建到啟動子上遊。兩個系統均需要共轉pRL-TK，用於表達RLuc的內參質粒。

圖3. 啟動子和轉錄因子互作雙荧光素酶質粒系統

圖4. 增強子/抑製子雙荧光素酶質粒系統

利用荧光素酶與底物結合發生化學發光反應的特性，把待研究的基因轉錄調控元件克隆在萤火蟲荧光素酶基因的上/下遊，構建成荧光素酶報告質粒，然後轉染細胞，經適當刺激或處理後裂解細胞，測定荧光素酶活性。通過荧光素酶活性高低判斷刺激前後或不同刺激對感興趣的調控元件的影響。同時可轉染表達R-Luciferase的內參載體pRL-TK質粒以校正不同樣品之間的轉染效率。

圖5. 雙荧光素酶系統反應過程

三、雙荧光素酶系統的應用

（1）潛在啟動子/啟動子核心區活性檢測

方法：截斷式檢測，逐步缺失遠端序列（因為核心啟動子位於靠近TSS端，缺失該處會喪失基本轉錄活性）；適用於確定啟動子核心區域或轉錄因子與啟動子預測結合位點較多且評分相近，需要進一步縮小範圍的情況。（攜帶目的啟動子的報告載體promoter、不攜帶目的啟動子的報告載體promoter-空載），一般選取目的基因上遊總長為2000bp堿基作為目標基因的啟動子序列。

圖6. 啟動子截斷示意圖

表1. 啟動子活性驗證雙荧光素酶實驗分組

1/2組去背景值後通過荧光素酶活性對比可驗證待測啟動子活性；2/3/4/5去背景值後可通過荧光素酶活性驗證待測啟動子核心區域。

（2）潛在增強子/抑製子等調控子活性檢測

將增強子/抑製子的調控元件構建至pGL3-Promoter報告載體（攜帶目的基因啟動子或廣譜啟動子啟動報告基因），並檢測雙荧光素酶活性。（增強子Enhancer舉例）

表2. 增強子活性驗證雙荧光素酶實驗分組

1/2組荧光素酶活性對比表示目的啟動子的啟動活性；1/3組荧光素酶活性對比表示增強子是否具備啟動轉錄活性；2/4組荧光素酶活性對比表示增強子對下遊基因啟動轉錄增強的效果。

（3）啟動子和轉錄因子互作驗證

轉錄因子結合至啟動子區域，並改變其啟動子性能的強弱，便可引起下遊報告基因Fluc轉錄水平發生變化，進而影響其蛋白翻譯，最終底物與荧光素酶反應發生變化，荧光強弱發生改變，最終達成互作性能驗證。

①驗證轉錄因子與啟動子是否有互作（轉錄因子過表達載體TF、過表達空載TF-空載）

表3. 啟動子和轉錄因子結合驗證雙荧光素酶實驗分組

②在四組的基礎上加上各個待驗證結合位點突變啟動子載體，以驗證轉錄因子與啟動子的詳細結合位點（結合位點1突變啟動子promoter-mut1、結合位點2突變啟動子promoter-mut2、結合位點3突變啟動子promoter-mut3，多一個待驗證結合位點，則加一組對應啟動子突變體+TF和啟動子突變體+TF-空載）

表4. 啟動子和轉錄因子結合位點驗證雙荧光素酶實驗分組

各組設置的意義：實驗組1，空載對照組；實驗組2，轉錄因子在無啟動子的情況下對Fluc表達的影響；實驗組3，檢測在無轉錄因子的作用下，啟動子對Fluc基因的轉錄作用強度；實驗組4，檢測在待驗轉錄因子的作用下，啟動子的轉錄活性是否會發生改變，用以判斷待驗的轉錄因子與啟動子是否存在互作關系；實驗組6-10：確定詳細結合位點。

四、實例分析

安徽醫科大學李維祖教授在研究颅內動脈瘤時發現NOX4在TNF-α誘導的A7R5細胞中被激活，抑製TRPC6-NFATC1信號通路可顯著下調NOX4的表達。為驗證NFATC1與 NOX4的結合機製，作者通過人轉錄因子數據庫（HumanTFDB）預測到NFATC1在人NOX4啟動子區域可能結合的3個位點。利用pGL3-basic構建了這3個可能結合位點（TFBSs）及相應位點突變的報告載體。結果顯示NFATC1可以直接結合NOX4啟動子，參與NOX4轉錄，並確定了NFATC1可以結合到NOX4啟動子的TFBS2和TFBS3上，調控NOX4的轉錄。這些發現為了解颅內動脈瘤的發病機製和延遲颅內動脈瘤的必要策略供應了依據。

圖7. NFATC1與 NOX4啟動子的雙荧光素酶驗證

天津環湖醫院李慶國發現在膠質瘤中KB-1460A1.5表現為低表達情況，為了解析這一機製，作者對KB-1460A1.5上遊區域進行了分析。首先通過PROMO網站篩選了可能與KB-1460A1.5結合的轉錄因子，並通過這些因子在膠質瘤中的表達與KB-1460A1.5的相關性分析發現YY1極有可能參與調控KB-1460A1.5的表達。通過構建YY1過表達載體及KB-1460A1.5啟動的pGL3載體進行雙荧光素酶報告基因檢測驗證。結果顯示，YY1可能與KB-1460A1.5啟動子結合，且YY1降低了KB-1460A1.5啟動子的荧光素酶活性，即YY1可能以負調控的方式調控KB-1460A1.5的轉錄表達。作者進而提出了KB-1460A1.5在膠質瘤中的作用機製，KB-1460A1.5可能是膠質瘤的治療靶點。

圖8. YY1與KB-1460A1.5啟動子雙荧光素酶驗證

本期幹貨內容主要為大家展現了雙荧光素酶報告系統在轉錄因子與啟動子互作、啟動子活性，增強子/抑製子活性的應用，包括原理及應用思路，並附上了兩篇實例文獻，希望對正在做這方面實驗的小夥伴有所幫助。下期我們將展現雙荧光素酶報告系統的拓展應用，感興趣的小夥伴可以持續關註留意一下哦~~~

參考文獻

[1] Sun ZH, Liu F, Kong LL, Ji PM, Huang L, Zhou HM, Sun R, Luo J, Li WZ. Interruption of TRPC6-NFATC1 signaling inhibits NADPH oxidase 4 and VSMCs phenotypic switch in intracranial aneurysm. Biomed Pharmacother. 2023 May;161:114480.

[2] Xu L, Wu Q, Yan H, Shu C, Fan W, Tong X, Li Q. Long noncoding RNA KB-1460A1.5 inhibits glioma tumorigenesis via miR-130a-3p/TSC1/mTOR/YY1 feedback loop. Cancer Lett. 2022 Jan 28;525:33-45.