@科研人：抗體選擇困難？性能、機製與應用場景全解析來了！

一、抗體的定義和結構

抗體（antibody）是指機體免疫系統在抗原刺激下，由B淋巴細胞分化成的漿細胞所產生的一類免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig），能夠與相應抗原發生特異性結合反應。早在19世紀80年代，科學家在研究病原菌的過程中就發現了抗體的存在，但直到20世紀60年代，其分子結構才得以明確（見圖1）。

圖1. 抗體結構

抗體的基本結構呈“Y”型，由兩條相同的重鏈（Heavy chain，H鏈）和兩條相同的輕鏈（Light chain，L鏈）通過鏈間雙硫鍵和非共價鍵連接而成。

整個抗體分子可分為恒定區（Constant Region，C區）和可變區（Variable region，V區）兩部分，C區位於“Y”型結構的底部，決定抗體的類型及其與免疫系統中其他成分協同作用的方式；V區位於“Y”型結構的頂端，負責識別並結合特定抗原，是抗體達成特異性結合的關鍵區域。

在V區內部，有一小段氨基酸序列變異程度極高，稱為高變區（hypervariable region，HVR）或互補決定區（complementarity determining region，CDR）。該區域通常由2~17個氨基酸殘基組成，其氨基酸殘基的種類、排列和立體構象具有高度多樣性，決定了不同抗體在結構上的細微差異，也是特異性結合抗原的關鍵部位，這一區域又被稱為抗原結合片段(antigen-binding fragment，Fab)。非HVR區的部分氨基酸序列相對保守，稱為骨架區（framework region，FR）。

每個抗體分子含有兩個相同的抗原結合部位，分別位於“Y”型結構的兩臂末端，即Fab段。該片段由完整的V區和CH1結構域共同構成，負責識別和結合抗原靶標，決定了抗體的特異性與親和力。“Y”型結構的柄部為結晶片段（fragment crystallizable，Fc），由CH2和CH3結構域組成，負責與免疫效應分子或細胞相互作用，從而激活下遊免疫應答。在CH1和CH2之間有一個铰鏈區，連接抗體的Fab段和Fc段，該區域賦予Fab段一定的靈活性與移動能力，使抗體能夠適應不同距離的抗原表位，從而更有效地執行性能。

二、抗體檢測原理

了解了抗體的結構後，其作用原理就更容易理解。抗體通過與抗原發生特異性結合來反映抗原的性質和含量。抗原表面存在抗原決定簇（表位），可被抗體特異性識別並結合。抗體與抗原決定簇之間的結合強度用“親和力”來表示。抗體的可變區（V區）通過氫鍵、範德華力等弱非共價作用與抗原表位結合，相互作用越強，則親和力越高，抗體的特異性也越強。在實際應用抗體之前，通常需要對其滴度、交叉反應性、特異性及親和力等性能進行系統鑒定。

圖2. 抗原抗體結合原理示意圖

（1）抗體滴度

抗體滴度（亦稱效價）的測定通常采用倍比稀釋法：將含抗體的血清、細胞上清或腹水等樣本進行稀釋，分別加入定量的標記抗原（Ag），經孵育後分離結合的抗原-抗體復合物（Ag*Ab，即B）與未結合的標記抗原（即遊離，F）。通過檢測相應信號，當結合部分與遊離部分之比（B/F）等於 1，即結合部分占總抗原量（T）的 50%（B/T = 50%）時，所對應樣本稀釋倍數的倒數即為該抗體的滴度。

（2）交叉反應

若某抗體僅與免疫原（iAg）的某一表位結合，稱為無交叉反應抗體；若能與其他抗原（含一個或多個結構相同或相似表位）結合，則稱為有交叉反應的抗體。這類可發生交叉反應的抗原稱為交叉反應原（cross reacting antigen，cAg）。

交叉反應的程度常用交叉反應率（C%）表示，計算公式如下：

交叉反應率（C%）= ED₅₀(cAg) / ED₅₀(iAg) × 100%

其中，ED₅₀(cAg) 指交叉反應原達到50%結合時的濃度，ED₅₀(iAg) 指免疫原達到50%結合時的濃度。

（3）特異性

抗體的特異性是指抗體結合抗原時的專一程度。若某抗體僅識別抗原的某一個表位，並能夠區分不同抗原之間一級結構、同分異構體或空間構象的差異，則稱為高度特異性抗體。特異性的高低可通過交叉反應率（C%）判斷：C% 值越小，表明抗體的特異性越高。

（4）親和力

抗體的親和力指一個單價抗體單位（如 Fab 段）與一個抗原表位相結合的速度、強度及穩定性。親和力大小通常以親和常數（KD）表示。最常用的計算方法是標準作圖法：以 B/F 為縱坐標、B 為横坐標繪製曲線，所得直線斜率的負數即為 KD 值。

三、抗體類別

根據重鏈恒定區的結構差異，可將其分為IgM、IgG、IgA、IgE、IgD五類。其中IgG結構穩定，持續時間長，易於獲得，是研究應用的首選抗體。

圖3 IgM、IgG、IgA、IgE、IgD結構示意圖

除了根據結構差異進行類別外，研究人員還常依據抗體的性能、靶標類型等對抗體進行進一步劃分。

1、根據抗體性能差異，抗體可分為單克隆抗體、多克隆抗體和重組抗體。

2、根據靶標類型分為目的基因特異性抗體和標簽特異性抗體。

基因特異性抗體直接檢測目的蛋白，操作方便，但僅可檢測特定蛋白，不能通用，成本相對較高，無法區分內源性和外源性蛋白。標簽特異性抗體通用性強，靈敏度高，可區分內源性和外源性蛋白，荧光蛋白標簽還可達成目的蛋白的示蹤，且成本相對較低。

3、根據結合的目標分子可分為一抗和二抗。一抗直接與目標抗原結合；二抗則識別一抗的恒定區，常用於信號放大和檢測。

在抗體製備過程中，常采用抗體標記技藝，將易檢測且高靈敏度的示蹤物質（如酶、荧光染料等）共價連接到抗體上，通過標記物的信號放大作用，達成對反應體系中抗原性質與含量的定性和定量分析。

若抗原特異性結合的一抗自身攜帶標記物，則可采用直接檢測法。但由於標記一抗製備成本較高，研究人員更常使用間接檢測法：即先使用未標記的一抗與抗原結合，再利用帶有標記的二抗與一抗結合，通過檢測二抗上的標記信號間接反映抗原的表達情況。常見的酶標記物如辣根過氧化物酶（HRP），以及荧光染料如FITC、PE、APC和PerCP等，均廣泛用於抗體標記。

一抗與二抗的物種匹配選擇尤為關鍵，通常遵循“二抗看一抗，樣本避一抗”的原則。即一抗的宿主物種應不同於樣本物種，以避免內源性免疫球蛋白的幹擾；而二抗則須針對一抗的物種來源進行選擇，確保其能夠特異性地識別並結合一抗。

圖4 抗體作用原理示意圖

四、抗體應用

抗體是分子生物學研究中不可或缺的工具，廣泛應用於對目標蛋白的檢測、定性與定量分析。以下列舉了幾類常見的抗體應用場景：

表1 抗體應用

註：WB、IF、Co-IP、ChIP漢恒生物公眾號均發表過實驗指南，可點擊對應實驗名稱前往察看。

漢恒生物現已推出抗FLAG小鼠單克隆抗體（M2表位）和HRP偶聯抗FLAG小鼠單克隆抗體（M2表位）兩款抗體商品，抗體針對DDDDK標簽（M2表位），結合FLAG標簽序列，靈敏度高，特異性強，用於定位和表征FLAG標記蛋白，適用於WB和Fc實驗。正在做WB或者Fc實驗的小夥伴可以申請試用裝哦~

圖5. WB實驗結果圖

圖6. Fc實驗結果圖

五、抗體選擇的關鍵考慮因素

不同實驗類型對抗體的性能要求各不相同。例如，Western Blot（WB）通常需要高特異性的抗體以最大限度減少交叉反應；免疫組化（IHC）和免疫荧光（IF）則要求抗體能夠識別處於天然構象的抗原；而對於固定和透化處理後的樣本，需選用經驗證適用於此類處理的抗體。因此，在選擇抗體時，除明確其推選應用範圍外，還需彙總考慮以下因素：

1、宿主物種的匹配性：

所選抗體的宿主物種應與實驗樣本的物種不同，以避免二抗與樣本內源免疫球蛋白發生交叉反應，從而影響結果特異性。

2、單克隆與多克隆抗體的選擇：

單克隆抗體：特異性高、批間一致性好，適用於定量實驗（如ELISA、流式細胞術）；

多克隆抗體：通常親和力較高、靈敏度好，更適合檢測低豐度蛋白或結構修飾性抗原。

以上就是本期的全部內容，從抗體的定義和結構出發，詳細展現了抗體的性能、類別和應用，下期將詳細展現抗體在流式細胞術中的應用，感興趣的同學可以關註一下哦~