CRISPR/Cas9系統的“百變”應用-敲入篇

在上一系列的幹貨分享中，我們展現了CRISPR-Cas9基因敲除系統（knock out）相關知識。接下來，我們將目光聚焦 CRISPR/cas9系統的另一應用——敲入，開啟一個新的篇章。本篇文章主要從實驗原理、HDR模板的選擇和實驗流程步驟三個方面來展現CRISPR-Cas9基因敲入系統（knock in）。

一、CRISPR基因敲入實驗原理

CRISPR-Cas9基因敲入（KI, Knock in）是指Cas9內切酶切割雙鏈DNA時，同時供應一段與靶基因高度同源的DNA修復模板，生物體即可啟動HDR修復路徑，將一段外源DNA定點插入基因內部。KI的外源基因可以是具有蛋白表達性能的編碼基因，可以是參與基因調控的DNA元件，也可以是一段沒有性能的DNA序列等。在該修復路徑中，需要將一段與預期編輯位點上下遊緊鄰序列具有高度同源性的DNA修復模板、特異的gRNA和Cas9核酸酶一起引入細胞中。在高度同源性DNA模板存在的情況下， HDR機製可以通過同源重組將一段DNA精準地插入特定的基因組位點。

目前CRISPR/Cas9 Gene Knock in系統可用於目的基因引入點突變，從而模擬人類遺傳疾病模型；或者將報告基因(如EGFP，mCherry，BFP等)通過同源重組的方式引入目的基因的特定位點，從而可以通過報告基因的表達跟蹤目標基因的表達；亦或將性能缺失的DNA片段修復為有性能的DNA片段，即可達成基因治療的目的。此系統的應用範圍不勝枚舉，已成為人類生物學、醫學、農業和微生物學等範圍有力的基因編輯工具。

圖1基於CRISPR/Cas9基因敲入的示意圖（Murillo-Rodríguez E et al., 2018）

二、如何選擇合適的CRISPR基因敲入HDR模板

基因敲入HDR模板的作用

在CRISPR基因敲入中，同源重組修復 (homology directed repair, HDR) 模板是一種用於指導修復DNA斷裂並達成精確基因敲入的DNA序列，與目標基因組中被Cas9剪切的位置具有相同序列的同源臂。無HDR模板的CRISPR基因敲入，細胞通過非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）方式修復Cas9切割的DNA斷裂。NHEJ修復方式速度快效率高，但易引起插入/缺失、突變等不良後果，故屬於相對不準確的修復方式，存在錯誤DNA連接和變異，敲入效率和精確性較低。使用HDR模板時，細胞將利用其內在的修復機製，與模板同源臂序列進行重組，精確地修復Cas9切割的DNA斷裂並達成精確基因敲入，可提高基因敲入效率和精確性，減少修飾誤差。

常用HDR模板及優缺點

（1）單鏈DNA（single-strand DNA, ssDNA）

ssDNA作為CRISPR基因敲入供體模板，由於其具有較簡單的核苷酸結構、非特異性整合概率低、細胞毒性較低等特性，可達成準確CRISPR基因敲入，在HDR修復中被廣泛使用。

優點：ssDNA在細菌和低等真核細胞中顯示出較好重組效率；易於合成和轉染到細胞中，且具有較高的HDR效率。ssDNA模板可用於點突變、小片段插入和删除等操作。

缺點：ssDNA插入的長度較短，不適用於大片段DNA的插入。

圖2 使用ssDNA作為模板誘導CRISPR-Cas9介導的雙鏈斷裂後HDR機製(Deshani et al.,2021)

（2）雙鏈DNA（double-stranded DNA, dsDNA）模板

dsDNA模板通常是通過PCR擴增、合成或從細胞中提取的DNA片段，通常包含目標序列及其周圍的同源序列，以提高HDR修復的效率。

優點：dsDNA模板可插入較長的DNA片段，適用於需要大片段DNA插入的基因編輯。

缺點：合成和轉染效率較低且其易被細胞中的核酸酶降解。dsDNA易被NHEJ修復途徑合並，從而導致同源臂復製或dsDNA模板的部分整合。通過NHEJ同源獨立性插入片段可能會發生雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）脫靶或者產生內源性DSBs。此外，dsDNA模板還存在細胞毒性，線型或質粒dsDNA轉染效率較低等短板。

圖3 使用長雙鏈DNA模板的CRISPR/Cas9介導的HDR策略(Sachiko et al.,2019)

（3）RNA模板

RNA可作為HDR模板參與 CRISPR/Cpf1介導的DNA同源重組修復。

優點：與DNA模板相比，RNA模板具有易於合成優勢。此外，RNA模板可在細胞內產生更高的修復效率，與RNA模板更易地被細胞攝取和轉錄成DNA，促進了同源重組修復的進程有關。同時RNA模板可避免DNA模板的不良影響（如細胞毒性、不良的基因重排和不必要的基因剪接事件等）。

缺點：由於RNA的易降解性和低穩定性，其在基因敲入中RNA模板的應用仍需進一步研究和優化。

圖4 crRNA和RNA DRT的製備示意圖(Shaoya et al.,2019)

（4）基因組DNA

基因組DNA同樣可作為CRISPR-Cas9介導的同源重組修復模板，用於達成精確的基因編輯。

優點：與其他類型的HDR模板相比，基因組DNA具有多個同源序列和大量的基因組信息，可用於達成較大範圍的基因編輯，包括基因敲除、修復、敲入等操作。

缺點：基因組DNA通常較大，不同細胞類型和不同基因組區域的大小也不同，因此不確定性較高，導致使用基因組DNA作為HDR模板時，不同細胞或不同基因組區域的編輯效率和準確性不同。此外，基因組DNA含有大量的序列信息，可能包含多個同源序列或非同源序列，增加基因編輯的難度和不正確重組率；使用基因組DNA作為HDR模板涉及到人類基因組信息時需遵守相關的倫理和法律規定，以確保實驗的安全和合法性。

圖5 CRISPR效應器(米色齒輪)與重組酶(灰色齒輪)結合，可與基因組等大序列DNA整合(Lei Tang et al.,2022)

在基因編輯技藝的CRISPR/Cas體系中，基於同源介導修復 (homology directed repair, HDR) 機製開展的基因敲入是其重要應用之一，合適的HDR模板是決定基因敲入成敗與效率的重要因素。

三、CRISPR基因敲入實驗流程步驟

（以敲入RFP蛋白為例）

1、構建sgRNA-Cas9質粒及修復DNA模板質粒

（1）確定敲入位點

①若敲入的片段不參與翻譯，則在想插入的附近策劃sgRNA即可，並且根據sgRNA位置附近的序列策劃donor載體（對于donor載體的策劃在後文會詳細展現）。

②若敲入的基因參與翻譯，並只是想讓該蛋白表達蛋白，那麽將外源基因插入到基因組中的safe harbor位點則是一個很好的選擇。幾乎所有的物種相應的針對其safe harbor的研究，人基因組的safe harbor有AAVS1，CCR5，以及ROSA26等。中國倉鼠的safe harbor有site A， T2，以及T9。需要註意的是將基因插到safe harbor處，需要一同準備promoter，enhancer等元件。

③若要敲入的基因參與翻譯，並需要與宿主蛋白形成融合蛋白，那麽需要考慮外源蛋白與宿主蛋白之間linker的問題，是使用剛性linker（rigid linker）還是柔性linker（rigid linker），還是選擇自剪切多肽（2A Peptide），抑或是不使用linker。

（2）策劃sgRNA

（策劃sgRNA的詳細步驟已在敲除篇中詳細展現，本文略）

（3）構建sgRNA-Cas9質粒

將策劃好的sgRNA構建到PHB-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)載體上。

圖6 PX459載體圖

（4）策劃donor質粒

①策劃並製作兩端同源臂（homologous arm）：截取sgRNA靶點上遊1000bp左右的序列，製作左同源臂（HA-L）；截取sgRNA靶點下遊1000bp左右的序列，製作右同源臂（HA-R）。

需要註意的是根據敲入位點，donor需要補齊一些序列，如需將RFP序列插入A基因終止密碼子後而sgRNA策劃的位置在終止密碼前10個氨基酸處，那策劃donor時需要將這10個氨基酸對應的堿基序列加在左側同源臂上。此外，donor質粒上sgRNA序列需要進行同義突變，防止重復編輯。

②將需要敲入的基因序列（RFP序列）放置於左右同源臂之間，一起合成克隆於pcDNA3.1載體上。

圖7 pcDNA3.1載體圖

2、將sgRNA-Cas9、修復DNA模版共轉目的細胞

用lipofiter3.0轉染試劑將上述兩種質粒轉染至目的細胞。

3、嘌呤篩選，檢測荧光

本例子做的荧光蛋白敲入可以直接根據紅色荧光信號進行分選。而其他的基因敲入需要根據gRNA質粒裏面的荧光進行篩選或者進行puro抗性篩選，然後通過PCR等手段檢測基因是否敲入。

4、PCR檢測基因組

為了證實在基因組DNA中敲入RFP，策劃靶向RFP上遊的5’同源臂和靶向RFP下遊的3’同源臂的一對引物。對照PCR產物大小即可知敲入是否成功。

5、單克隆分選

前期工作：準備好96孔板，在96孔板的四周加上300ul的DPBS（含雙抗），中間6×10的孔中，加入300ul完全培養基（含雙抗）。最後用無菌的parafilm封好四周。

（1）將轉染結束的細胞消化下來

（2）500xg離心3min，用PBS重懸

（3）細胞懸液過300目細胞篩，篩出單細胞懸液

（4）加入PBS和培養基的96孔板，以及單細胞懸液一同置於冰上，等待流式分選

（5）上機分選，準備好的60個孔，每個孔分選入1個細胞

（6）分選後仍然將96孔板放在冰上保存

（7）將細胞放回培養箱中培養，5天後換液

（8）等待細胞分裂增殖到超過50%匯合度（一般會需要2周時間）

（9）消化細胞，隨後利用孔板離心機離心細胞，棄消化液

（10）加入300 μl完全培養基到每個孔中，平均傳到兩塊96孔板中（150 μl每孔），一塊用於傳代，一塊用於PCR鑒定

（11）通過策劃引物，進行PCR，檢測基因是否敲除

（12）為進一步驗證，將PCR產物送去Sanger測序

6、將敲入正確的多個單克隆進行擴增並凍存

需要註意的是盡可能多留幾株不同的單克隆，以免某些單克隆的細胞特征與WT細胞差異過大。（一般文章中會使用3個不同的單克隆）

本期內容針對CRISPR-Cas9基因敲入系統（knock in）的實驗原理、HDR模板的選擇、及實驗流程步驟等三大方面進行了詳細展現，希望對CRISPR-Cas9基因敲入系統研究方向的小夥伴可以有所裨益。下期我們將繼續為大家展現CRISPR-Cas9系統在轉錄調控中的應用，敬請關註！

參考文獻：

[1] Murillo-Rodríguez E,Rocha B N,Veras B A, et al. The End of Snoring? Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing for Sleep Disorders[J].Sleep and Vigilance, 2018,2(1).

[2] Sachiko Okamoto, et al. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Sci Rep 2019, 4811.

[3] Deshani C. Ranawakage, et al. Efficient CRISPR-Cas9-Mediated Knock-In of Composite Tags in Zebrafish Using Long ssDNA as a Donor. Front Cell Dev Biol 2021,8:598634.

[4] Shaoya Li, et al. Precise gene replacement in rice by RNA transcript-templated homologous recombination. Nature Biotechnology 2019,37,445–450.

[5] Lei Tang, et al. Loading large DNA cargoes. Nature Methods 2023,20,33.8. Jinlin Wang, et al. Efficient targeted insertion of large DNA fragments without DNA donors. Nature Methods. 2022,19,331–340.