自噬幹貨分享系列之線粒體自噬的研究策略

上期我們展現了自噬幹貨分享系列之內質網自噬的研究策略，那麽本期將繼續進行“自噬幹貨分享”，本期內容主要從線粒體自噬類別、介導線粒體自噬的經典通路、線粒體自噬的誘導與抑製來進行展現。

什麽是線粒體自噬？

在ROS、營養缺乏、細胞衰老等外界刺激的作用下，細胞內的線粒體發生去極化出現損傷，損傷的線粒體被特異性包裹進自噬體中並與溶酶體融合，從而完成溶酶體的降解，這個過程稱為線粒體自噬。線粒體自噬是細胞在應對氧化應激等壓力條件下的生物學狀況，用於清除多余的或者性能失調的線粒體，以維持線粒體數目和品質的平衡，對於整個線粒體網絡的性能完整性和細胞生存來說十分關鍵。

線粒體自噬類別

1、基礎線粒體自噬：細胞持續清理衰老和損傷的線粒體，確保線粒體能循環利用。線粒體自噬水平較高的器官包括：心臟、肝臟、肾臟、骨骼肌和神經系統等；

2、應激誘導型線粒體自噬：細胞外應激信號會影響線粒體的生理性能，並且會引起線粒體膜電位消耗，導致急性線粒體清除；

3、程序性線粒體自噬：程序性線粒體自噬會在不同細胞的發育過程中被激活，包括視網膜神經節細胞發育，體細胞向多能幹細胞的化學重編程過程，心肌細胞的成熟，紅細胞分化，受精後精子來源的線粒體清除等過程。

圖1.線粒體自噬的類別[1]

介導線粒體自噬的經典通路

1、 PINK1/Parkin信號通路。在健康的線粒體中，PTEN誘導激酶1（PINK1）通過線粒體靶向序列靶向線粒體，並通過TOM/TIM復合體進入到線粒體內膜，隨後PINK1被線粒體內膜中的蛋白酶PARL切割，並最終被蛋白酶體降解。當線粒體受損時，線粒體膜電位下降，PINK1無法進入線粒體內膜並在線粒體外膜積累，激活並招募Parkin，Parkin介導線粒體底物泛素化，泛素化後，包括p62在內的受體蛋白在線粒體外膜積累，導致泛素化產物通過與LC3結合被招募到自噬體中，成熟的自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，包含的線粒體隨後被降解。

圖2.PINK1-Parkin介導的線粒體自噬[1]

2、 BNIP3/NIX信號通路。BNIP3和NIX均位於線粒體的外膜，在缺血、缺氧的條件下，BNIP3 可通過以下2 種途徑誘導細胞內線粒體自噬的發生：①BNIP3能通過其BH3結構域調控自噬的核心蛋白Beclin-1競爭性地與Bcl-2結合，進而誘導Beclin-1的大量釋放，激活線粒體自噬的發生；②BNIP3的N端具有LIR序列，其可識別LC3，並與之直接結合，從而誘導線粒體自噬的發生。

圖3.受體介導的自噬[1]

3、FUNDC1信號通路。FUNDC1是調控線粒體自噬的關鍵受體。在正常條件下，FUNDC1被酪氨酸激酶磷酸化，此時與LC3的親和力降低在缺血缺氧條件下酪氨酸激酶被滅活，FUNDC1與LC3的親和力顯著提升，並且FUNDC1可以被絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶通過去磷酸化的形式激活，進而誘導線粒體自噬的發生。

線粒體自噬研究工具

線粒體自噬受到了越來越廣泛的關註，那麽我們如何直觀地研究線粒體自噬呢？漢恒生物供應的線粒體自噬病毒研究工具，便於感染目的細胞後直觀地觀察線粒體自噬的變化。EGFP-LC3單標記的荧光探針可以監測 LC3 蛋白參與自噬起始過程，Mito-dsred線粒體特異性定位荧光探針可定位線粒體，兩者共轉染細胞即可準確實時地追蹤線粒體自噬的變化過程。另外，mt-Keima探針可獨立應用於線粒體自噬的研究，Keima是一種H敏感的荧光蛋白，發射峰為620nm，在中性和酸性環境中分別於440nm和550nm處被激發，因此，隨着時間的推移，遞送到溶酶體的keima量可以通過在550nm處激發的信號強度和在440nm處激發的信號強度的比值來估計。鑒於發生自噬的線粒體最終會進入酸性的溶酶體中，所以將特異性定位於線粒體（mitochondrial）基質的靶向序列與keima融合形成mt-keima，可指示通過自噬途徑進入溶酶體中的線粒體。另外，我們還有Cox8a基因融合綠光和紅光（Cox8a-EGFP-mcherry）來研究線粒體自噬的病毒。

漢恒生物還有多種線粒體自噬通路單標研究工具Parkin-EGFP、Bnip3-EGFP、Nix-EGFP、FUNDC1-EGFP，與Mito-dsred線粒體共感染目的細胞，confocal檢測共定位情況，可鑒別相關信號分子的線粒體轉位。

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本期“線粒體自噬研究”展現就到此結束了，相信看到這裏的小夥伴一定有所收獲，對於線粒體自噬也更加了然於心。下期我們將展現“分子伴侣介導的自噬”，我們下期再見！

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