自噬幹貨分享系列之內質網自噬研究

上期為大家展現了自噬幹貨分享系列之經典自噬研究，那麽本期將繼續進行“自噬幹貨分享”，小編將帶大家一起來了解下內質網自噬。

內質網是真核細胞中的一種多性能細胞器，在蛋白質折叠、修飾、脂質和激素合成、離子儲存、代謝調節等多種細胞過程中發揮重要作用。當細胞受到內外因素刺激時，未折叠或錯誤折叠的蛋白質在內質網中大量積累，內質網的穩態就會受到破壞。此時，細胞會啟動自我保護程序，即未折叠蛋白反應（unfolded protein response，UPR），增強蛋白折叠活性，降低蛋白翻譯水平，加速內質網相關蛋白降解（ER-associated protein degradation，ERAD）。持續地內質網應激和未折叠蛋白反應可激活內質網自噬（ER-phagy），以維持內質網的穩態平衡。

Bernales等人在2007年首次提出了內質網自噬的概念。內質網自噬可分為（圖1）：大內質網自噬（是由內質網駐留受體或內質網相關受體介導，這些受體招募自噬機製，然後將內質網靶向到自噬體中，包裹內質網碎片的自噬體與溶酶體融合以降解其內容物）；微內質網自噬（不需要受體或形成自噬體，內質網碎片直接被溶酶體吞噬）；此外，溶酶體也可直接與內質網來源的囊泡融合並進行降解（需要內質網自噬受體介導，但不涉及自噬體的形成），這一過程也稱作ERLAD（ER-to-lysosome-associated degradation）。

圖1. 內質網自噬

本期內容主要從內質網自噬過程、內質網自噬受體、內質網自噬監測方法及應用實例來進行展現。

1、內質網自噬過程

大內質網自噬是一個多步驟的過程：在內質網應激的誘導下（如未折叠蛋白反應、蛋白質聚集、營養缺乏和內質網結構破壞等），需要降解的內質網成分可以被特定的內質網自噬受體識別和標記。同時，細胞通過抑製mTOR或AMPK直接磷酸化Atg1/ULK1（哺乳動物中Atg1的同源物）來激活自噬體起始復合物，從而啟動隔離膜的組裝。類泛素蛋白Atg8/LC3/GABARAP將被招募到形成中的隔離膜上來幫助膜擴張，並識別和結合內質網自噬受體。之後，隨着隔離膜逐漸擴張和閉合，與待降解的內質網子域以及內質網自噬受體形成自噬體，最終自噬體與溶酶體融合並降解底物（圖2）。

圖2.大內質網自噬

微內質網自噬：在酵母中，當出現內質網應激或內質網過度擴張時，一部分內質網可以形成輪狀結構，然後被內陷的液泡膜吸收到液泡中進行降解。在哺乳動物細胞中，突變的I型前膠原蛋白可以被募集到 ERES（ER exit sites，內質網出口位點），COPII 外殼蛋白和自噬相關蛋白（SQSTM1、LC3 等）也可以被募集到這一位點，然後包含這些蛋白的ERES通過泛素化修飾並在微自噬等過程中被溶酶體吞沒。

ERLAD：當α1-抗胰蛋白酶Z（ATZ）聚合物在內質網中積聚時，分子伴侣蛋白如CALNEXIN可以將聚集體所在的內質網亞區分離。然後，在內質網自噬受體FAM134B的協助下，在該區域形成來源於內質網的、單層膜囊泡。此外，FAM134B與LC3的結合可以促進囊泡對RAB7/LAMP1陽性的內吞溶酶體膜的對接。最終，包含聚集體的囊泡與內吞溶酶體融合而被降解。

2、內質網自噬受體

2015年Nakatogawa和Dikic團隊分別在nature雜誌報道了酵母和哺乳動物中第一個內質網自噬受體Atg40和FAM134B。到目前為止，哺乳動物中已經有11個內質網自噬受體被報道，FAM134B、FAM134A、FAM134C、RTN3L、CCPG1、SEC62、TEX264、ATL3、CALCOCO1、p62和CDK5RAP3（圖3）。

圖3.內質網自噬受體

在酵母中，內質網自噬受體通過Atg8互作基序（Atg8-interacting moti，AIM）與自噬體上的Atg8結合，促進內質網被自噬體包裹。在哺乳動物中發現了6個Atg8同源物，包括LC3 的3種亞型（LC3A, LC3B和LC3C）和γ-氨基丁酸（GABA）-A型受體相關蛋白的3種亞型（GABARAP，GABARAPL1和GABARAPL2）。與酵母中內質網自噬受體和Atg8之間的相互作用一樣，哺乳動物中內質網自噬受體也通過LC3互作區（LC3-interacting

Region，LIR）與LC3和GABARAP家族蛋白結合，從而促進內質網片段被自噬體包裹。

3、內質網自噬監測方法

內質網自噬活性監測對於闡明內質網自噬的分子機製、生理和病理作用以及尋找調節內質網自噬的藥物具有重要意義。

透射電子顯微鏡可以觀察內質網自噬（圖4），但無法衡量內質網自噬活性。一些內源性內質網蛋白（如RTN1、RTN3、RTN4、REEP5、CLIMP63和Trap-α）在自噬中表達水平下降，但變化通常很小。相比之下，饑餓誘導的內質網自噬受體蛋白（如CCPG1和TEX264）的降解更明顯，但它們是選擇性降解的，並且在內質網自噬過程中也可能被誘導轉錄表達，不太能真實反應內質網自噬水平。但荧光標記的報告載體是自噬研究最常用的手段，如漢恒生物自噬研究的 “王牌工具” mcherry-EGFP-LC3自噬雙標病毒等，可以靈敏地衡量自噬水平。

圖4. 小鼠肾組織內質網自噬透射電鏡圖（紅色箭頭表示內質網膜，黑色箭頭表示自噬體膜）

基於此，漢恒生物嶄新推出了內質網自噬監測工具。通過將內質網定位序列與RFP-GFP荧光串聯序列融合表達來構建內質網自噬報告載體ssmRFP1-EGFP-KDEL（ss：內質網信號肽序列，ER signal sequence；KDEL內質網滯留序列）（圖5A）和mCherry-EGFP-RAMP4（RAMP4：即SERP1基因，Stress-associated endoplasmic reticulum protein 1，可以特異性定位到內質網膜上）（圖5B）。在細胞質中，紅色荧光蛋白和綠色荧光蛋白同時表達，表現為黃色；若發生內質網自噬，由於溶酶體偏酸性的環境，綠色荧光蛋白淬滅，只剩下紅色荧光信號。此外，在溶酶體中，報告載體ssmRFP1-EGFP-KDEL中的mRFP1與EGFP間的linker會被剪切，因此也可通過Western Blot結果分析mRFP1/mRFP1-EGFP比值來指示內質網自噬。

圖5. 漢恒內質網自噬監測工具原理圖

4、應用實例

2019年東京大學研究團隊為了研究TEX264是否為內質網自噬受體，利用ssmRFP1-EGFP-KDEL工具對野生型WT、FIP200-KO（自噬性能缺陷）及TEX264-KO的HeLa細胞在營養和饑餓條件下進行了內質網自噬監測，並通過在TEX264-KO的HeLa細胞中回補TEX264野生型及LIR突變型LIR4A，結合荧光成像（圖6A，圖6B)和Western Blot實驗（圖6C，圖6D)，證明了TEX264是一個內質網自噬受體。

圖6. ssmRFP1-EGFP-KDEL工具監測HeLa細胞內質網自噬

威斯康星大學研究團隊2021年的文章中為了研究Atase1或Atase2的敲除是否會促進內質網自噬，利用mCherry-EGFP-RAMP4工具在小鼠胚胎成纖維MEF細胞中監測內質網自噬。通過荧光成像（圖7），分析有紅色荧光斑點的細胞占比（指示自噬溶酶體），證明了Atase1敲除，而不是Atase2敲除，會促進內質網自噬。

圖7. mCherry-EGFP-RAMP4工具監測MEF細胞內質網自噬

本期“內質網自噬研究”的展現就到此結束了，希望可以幫助大家了解到一定的內質網自噬基礎知識，並對內質網自噬監測報告載體有一定的認識。下期我們將繼續“自噬幹貨分享之線粒體自噬研究”，我們下期見哦。

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