Molecular Cell丨線粒體品質控製新機製：β-羟丁酰化修飾調控線粒體囊泡生成拮抗氧化應激損傷

在包括代謝性疾病、癌癥、神經退行性疾病和心血管疾病在內的各種人類病癥中，都可觀察到線粒體平衡失調的狀況，維持線粒體的平衡對正常的細胞生理至關重要。線粒體衍生囊泡（mitochondrial-derived vesicles, MDVs）的形成已成為一種線粒體品質控製（mitochondrial quality control, MQC）機製，以確保線粒    體的健康和性能。已有研究表明，β-羟基丁酸（β-hydroxybutyrate, BHB）可以提高線粒體品質，並驅動組蛋白和非組蛋白的β-羟基丁酰化修飾（lysine β-hydroxybutyrylation, Kbhb），調節基因表達和細胞信號傳導。然而，目前還不清楚BHB是否參與調節MDV的形成。

2025年3月20日，四川大學賈大教授團隊在Molecular Cell上發表了題為“β-hydroxybutyrate facilitates mitochondrial-derived vesicle biogenesis and improves mitochondrial functions”的研究論文。研究中，作者發現BHB可促進MDV形成關鍵調控因子SNX9（sorting nexin-9）在三個特定賴氨酸殘基上的Kbhb修飾，增加了SNX9與線粒體內膜（inner mitochondrial membrane, IMM）/基質蛋白的相互作用，促進IMM/基質MDV的形成，從而抵抗應激誘導的線粒體損傷。

漢恒生物有幸為作者供應了AAV8-TBG-Flag-Zsgreen-Snx9 WT和AAV8-TBG-Flag-Zsgreen-Snx9 3KR，用於小鼠肝臟中野生型Snx9(WT)和突變型Snx9(3KR)的過表達；以及RNAFit試劑，用於HCC-LM3或HEK 293T細胞的siRNA轉染實驗。

1. BHB可抵抗應激誘導的細胞和小鼠肝臟線粒體損傷

生酮飲食和BHB補充劑已被證明可改善肝線粒體性能。為了驗證BHB是否直接調節肝細胞線粒體性能，作者在侵襲性肝癌細胞HCC-LM3中進行了實驗。結果顯示，CCCP（線粒體氧化磷酸化解偶聯劑）處理顯著降低了線粒體膜電位並增加ROS水平，而BHB的添加有效逆轉了這些效應，並提高了ATP的生成。這些結果表明，BHB具有提高線粒體效率和抵抗應激誘導的細胞線粒體損傷的潛力。

酒精與CCCP相似，可誘導產生ROS並激活氧化應激，此前研究已發現BHB可以保護小鼠免受酒精引起的肝損傷。為了探究BHB對小鼠肝臟線粒體的作用，作者建立了酒精誘導的肝損傷小鼠模型。結果顯示添加BHB能顯著提高模型小鼠肝臟中ATP的產生和線粒體膜電位，並降低ROS積累。彙總這些結果，BHB在小鼠模型中同樣能有效抵禦酒精導致的肝臟線粒體損傷。

已有研究表明BHB可誘導蛋白質Kbhb修飾。因此，作者推測BHB可能通過Kbhb改善線粒體性能。實驗結果表明，在HCC-LM3細胞中，BHB濃度依賴性提高了Kbhb的水平，p300（Kbhb修飾關鍵酶）在BHB和CCCP處理後向細胞質轉移，這表明p300可能參與修飾線粒體蛋白。利用p300抑製劑C646處理HCC-LM3細胞，可以劑量依賴性降低Kbhb水平；在Kbhb水平降低的同時，CCCP和BHB處理的細胞線粒體膜電位以及ATP的產生也顯著降低；而在沒有BHB的情況下，C646並沒有顯著改變線粒體膜電位，這表明C646是通過抑製Kbhb發揮作用的。為了進一步驗證p300的作用，通過siRNA敲低p300表達，結果同樣顯著降低了線粒體膜電位和ATP的產生。這些實驗證據表明，BHB可能通過增強Kbhb修飾水平，在細胞和小鼠肝臟中抵抗應激誘導的線粒體損傷。

圖1. p300是細胞中負責蛋白質Kbhb的關鍵酶

圖2. BHB保護細胞和小鼠肝臟免受應激誘導的線粒體損傷

2. β-羟基丁酰化修飾組學揭示了BHB通過Kbhb增強線粒體性能的潛力

為了闡明Kbhb修飾如何調控線粒體性能，作者通過PASEF-MS/MS技藝對CCCP和BHB先後處理的HCC-LM3細胞進行了β-羟基丁酰化修飾組學分析。在檢測到的3142種蛋白質中發現了7737個Kbhb修飾位點。每種蛋白質的Kbhb位點數量各不相同，大多數（1500個，占47.74%）只有一個位點，而51個蛋白質表現出超過10個位點的顯著Kbhb修飾，其中許多蛋白質對線粒體性能至關重要。在MaxQuant得分超過200分（高置信度）的Kbhb位點中，多達四分之一來自線粒體蛋白，這些蛋白分布於線粒體各分區，並涉及9個性能組，表明BHB誘導的Kbhb修飾可能參與了線粒體性能的調控。為深入解析BHB影響線粒體性能的分子機製，作者比對了148個MQC相關蛋白，其中約有三分之一存在β-羟基丁酰化，說明BHB可通過Kbhb調節MQC蛋白來增強線粒體性能。

在受Kbhb影響的與MQC相關的主要通路中，MDV形成通路最為突出，質譜分析鑒定了參與MDV形成的多種蛋白質，包括在MDV形成或斷裂中起作用的SNX9、OPA1和DNM1L，以及調節MDV與溶酶體融合的CENPF、VAMP7和SNAP29。鑒於目前對MDVs調節機製及其與MQC的相關性了解有限，作者提出了Kbhb通過控製MDV形成過程來調節線粒體性能的可能性。SNX9作為參與調節MDV形成和網格蛋白介導的胞吞作用的多性能蛋白，被選作後續研究的重點靶標。

圖3. β-羟基丁酰化修飾組學揭示了Kbhb在調節線粒體性能中的潛在作用

3. BHB促進SNX9在賴氨酸202, 207和267位點Kbhb修飾

為了明確BHB是否誘導SNX9發生β-羟丁酰化修飾，作者首先檢測了BHB處理的HCC-LM3細胞中SNX9的修飾狀態。結果顯示，BHB處理顯著誘導了SNX9的Kbhb水平，但乙酰化修飾水平沒有明顯改變，說明BHB在HCC-LM3細胞中特異性地促進SNX9的Kbhb修飾。

為進一步確定Kbhb修飾位點，通過免疫沈澱富集BHB處理細胞中的SNX9蛋白，並采用UPLC-MS/MS進行分析。MS分析揭示了SNX9中三個潛在的Kbhb位點：賴氨酸202 (K202)、賴氨酸207 (K207)和賴氨酸267 (K267)。接着作者將候選賴氨酸殘基突變為精氨酸(K/R)來模擬去β-羟丁酰化修飾，該氨基酸與Lys結構相似，但不能被β-羟丁酰化修飾。通過轉染FLAG-SNX9野生型(WT)、K202R、K207R、K267R或3KR (K202R/K207R/K267R)質粒，並用BHB處理24小時以誘導Kbhb修飾，WB檢測發現所有單突變體的SNX9 Kbhb水平均有所降低，而3KR突變體中的Kbhb降至最低。這些結果不僅證實了SNX9確實發生Kbhb修飾，更精確定位了K202、K207和K267三個賴氨酸殘基為其主要修飾位點。

圖4. SNX9在三個特定的賴氨酸殘基上被β-羟丁酰化

4. SNX9 Kbhb提高細胞中線粒體的效率

作者利用CRISPR-Cas9技藝構建了SNX9敲除(KO) HCC-LM3細胞，以研究SNX9 Kbhb修飾對線粒體適應性的調控作用。用CCCP處理細胞，SNX9 KO顯著降低了線粒體膜電位、增加了ROS水平，而補充BHB僅部分緩解這些變化。證實了SNX9在BHB調節的線粒體性能中起重要作用。

接下來，作者通過將賴氨酸殘基突變為谷氨酰胺(K/Q)構建了模擬Kbhb修飾的突變體。將SNX9 WT，3KR或3KQ（K202Q/K207Q/K267Q）重新轉導進SNX9 KO細胞。用CCCP處理細胞，SNX9 WT的重新表達顯著增加了線粒體膜電位並降低了ROS水平，更重要的是SNX9 3KQ突變體可以進一步增加線粒體膜電位、降低ROS水平，而3KR突變體則無此改善作用。這說明K202、K207和K267處的Kbhb可以改善線粒體品質。進一步的驗證實驗顯示，相對於表達SNX9 3KR，表達SNX9 WT的細胞中，BHB處理能顯著增加線粒體膜電位；而C646處理能降低表達SNX9 WT細胞的膜電位，證實了p300介導的SNX9 Kbhb的重要性。與表達SNX9 WT和3KR相比，SNX9 KO細胞中表達SNX9 3KQ顯示出更高水平的最大線粒體呼吸速率和ATP產量。這些結果共同證明SNX9的Kbhb改善了細胞中線粒體的性能。

圖5. SNX9 Kbhb改善細胞線粒體性能

5. SNX9 Kbhb對小鼠酒精性肝損傷的保護作用

為了驗證SNX9 Kbhb修飾在體內對線粒體性能的調節作用，作者通過CRISPR-Cas9技藝構建了Snx9 KO小鼠，采用肝臟特異性腺相關病毒在小鼠肝組織中回補表達SNX9 WT或3KR突變體。通過酒精誘導肝損傷模型結合BHB治療發現，與對照組或SNX9 3KR表達組相比，回補表達SNX9 WT小鼠表現出血漿ALT和AST水平顯著降低、肝脂肪變性有所改善以及線粒體性能增強（ATP合成增加、線粒體膜電位增加和ROS水平降低）。進一步分析顯示，表達SNX9 3KR突變體小鼠的SNX9 Kbhb水平顯著降低，表明不論在細胞還是體內，K202、K207和K267都是主要的Kbhb位點。總之，研究證實了SNX9的Kbhb修飾通過改善線粒體性能保護小鼠免受酒精誘導的肝損傷。

圖6. SNX9 Kbhb對小鼠酒精性肝損傷的保護作用

6. SNX9 Kbhb促進與IMM/基質蛋白相互作用，驅動IMM/基質MDV的形成

鑒於線粒體自噬在維持線粒體穩態中的關鍵作用，作者探究了SNX9的Kbhb是否通過線粒體自噬改善線粒體性能。因此構建了ATG7 KO的HCC-LM3細胞系（ATG7破壞線粒體自噬和其他典型的自噬途徑），然後將SNX9 WT、3KR或3KQ質粒轉染ATG7 KO細胞。當用CCCP處理細胞時，SNX9 WT表達顯著增加了線粒體膜電位、ROS水平顯著降低；相對於SNX9 WT，表達SNX9 3KQ可以進一步增加線粒體膜電位、降低ROS水平。這些結果表明SNX9的Kbhb獨立於線粒體自噬調節線粒體性能。

圖7. SNX9 3KQ獨立於線粒體自噬調節線粒體性能

作為線粒體自噬的替代方式，線粒體可以產生MDV，將受損的線粒體成分直接轉運至溶酶體進行降解。根據貨物選擇性，主要有兩種類型的MDV：穩態條件下的TOM20+/PDH-和氧化應激誘導的TOM20-/PDH+。已有研究報道，SNX9在MDV的形成過程中發揮作用。因此，作者探究了SNX9 Kbhb是否通過調節MDV的形成來改善線粒體性能。在穩定表達TOM20-mCherry的COS-7細胞中轉染SNX9 WT、3KR或3KQ質粒，用CCCP處理細胞後發現，過表達SNX9 WT顯著增加了TOM20-/PDH+ MDV的數量，但不影響TOM20+/PDH- MDV；SNX9 3KQ則進一步增加了TOM20-/PDH+ MDV的生成，同樣，對TOM20+/PDH- MDV的影響較小。結合之前的報告，說明SNX9的Kbhb能特異性地驅動TOM20-/PDH+ MDV的形成，促進受損的線粒體組分或激活下遊途徑而有益於線粒體性能。

為進一步確定BHB治療是否通過促進MDV的形成來增強線粒體性能，以及SNX9在該過程中的重要性,作者用呼吸鏈復合物抑製劑抗黴素A（anti-A）處理細胞誘導線粒體損傷後補充BHB。補充BHB顯著促進了WT細胞中TOM20-/PDH+ MDV的形成；但在SNX9 KO細胞中，BHB未能增加TOM20-/PDH+ MDV的數量。表明BHB至少部分依賴於SNX9以改善線粒體性能。

為闡明SNX9 3KQ促進TOM20-/PDH+ MDV的形成機製，作者將SNX9 WT或3KQ的質粒轉染HEK293T細胞，通過定量MS比較了SNX9 WT和3KQ的相互作用體。從2276個蛋白質中鑒定出248個差異互作蛋白質，其中43個是線粒體蛋白，它們分布在不同的線粒體區室中。接着重點研究了幾種IMM蛋白：OPA1、AGK和STOML2。與質譜結果相印證，免疫共沈澱實驗結果表示SNX9 WT與OPA1、AGK和STOML2存在特異性結合，SNX9 3KQ能富集另外的OPA1和STOML2，但對AGK沒有影響；BHB處理導致SNX9 WT富集的OPA1和STOML2增加。

基於上述分析，作者策劃構建了SNX9 Δ202-207突變體（去除K202和K207，保留K267Q突變）。與SNX9 3KQ相比，Δ202-207突變體與OPA1和STOML2的互作明顯減少，TOM20-/PDH+ MDV的數量也顯著降低，但TOM20+/PDH- MDV不受影響。彙總上述結果，證實了SNX9 Kbhb通過增強與IMM/基質蛋白（如OPA1和STOML2）的相互作用促進IMM/基質MDV的形成。

圖8. SNX9 Kbhb增強與IMM/基質蛋白的相互作用，促進IMM/基質MDV形成

總結

綜上所述，本研究發現酮體的主要成分BHB通過促進細胞系和小鼠肝臟中MDV的形成來促進線粒體性能和抵抗應激誘導的線粒體損傷。該發現不僅闡明了代謝物通過MDV生成調節線粒體品質的機製，更強調了BHB在減輕氧化應激誘導的線粒體損傷中的重要性。這意味着靶向BHB和SNX9 Kbhb可能成為預防和治療線粒體性能障礙相關疾病的新型幹預策略。

圖9. BHB促進MDV的形成和改善線粒體性能模式圖