IF=15.8 |當CRISPR遇見miRNA，西安交大王福團隊開發智能基因“開關”，並適配多種應用場景

CRISPR-dCas9系統作為基因編輯範圍的革命性工具，無需切割DNA即可精準調控內源基因的表達，在疾病治療中展現出巨大的潛力。然而，其臨床應用始終受限於時空控製這一難題。傳統的外部調控策略面臨根本性挑戰：化學誘導劑（如雷帕黴素）難以清除且會幹擾關鍵信號通路（如mTOR信號），而光控系統則因組織穿透性差與細胞光毒性難以達成深層組織調控，使得脫靶效應與系統安全風險難以克服。突破瓶頸的關鍵在於尋找可靠的內源性調控分子。miRNA在特定生物學背景下呈現的時空特異性表達模式，與細胞狀態及疾病進程緊密相關，為基因編輯系統活性的精確時空調控供應了達成的可行性。

2025年3月24日，西安交通大學王福教授團隊在《ACS Nano》（IF=15.8）上發表題為“Toehold-Based CRISPR-dCas9 Transcriptional Activation Platform for Spatiotemporally Controllable Gene Therapy in Tumor and Diabetic Mouse Models”的研究論文。本研究旨在開發一種細胞特異性miRNA響應型CRISPR-dCas9轉錄激活系統（命名為mCTA），通過創新性連接toehold基因開關以調控dCas9-VPR的表達。Toehold開關具有miRNA特異性，當目標miRNA存在時，toehold開關被激活，解除對dCas9-VPR的轉錄抑製，進而啟動mCTA系統；反之，則系統關閉。在應用上，mCTA系統達成了雙重突破：一方面利用細胞特異性內源miRNA達成了對CRISPR-dCas9系統的精確調控，規避了傳統外部調控策略的缺陷；另一方面建立了多性能平臺，既可應用於示蹤發育過程中miRNA的變化變化，又能在動物水平精準激活下遊性能基因的表達，達成腫瘤治療與血糖水平的改善，為將來應用於生物醫學成像與基因治療範圍奠定了基礎。

漢恒生物有幸為作者供應了本研究所用的sgRNA，為mCTA系統工具的成功激活供應了幫助。

下面我們一起來看看作者是如何構建並驗證mCTA系統的：

一、mCTA基因激活系統策劃

作者策劃的mCTA系統，其原理是由toehold開關調控dCas9-VPR的表達（圖1）。Toehold開關是一種特殊的莖環結構，通過策劃特定miRNA互補序列形成“基因鎖”。當目標miRNA存在時，其作為“密钥”與toehold結合，使系統進入“開啟”狀態，dCas9-VPR可正常表達並在sgRNA的引導下結合到7*TRE序列，進而調控下遊目的基因的轉錄。反之，當目標miRNA缺失時，toehold保持鎖定狀態，阻斷dCas9表達使系統關閉。

圖1. mCTA系統示意圖

二、 mCTA基因激活系統的特性及優化

接着，作者通過一系列實驗驗證證實並優化了mCTA系統。首先，在293 T細胞中構建了可響應miR-21的m21CTA系統，以萤火蟲荧光素酶（Fluc）作為下遊報告基因，設置三組對比實驗，結果證實了該系統的成功構建及特異性（圖2 A-C）：

（1）不含toehold開關的CTA組，可持續表達dCas9-VPR，顯示較強Fluc信號；

（2）含toehold開關的m21CTA組，因dCas9-VPR表達被抑製而導致Fluc信號顯著降低；

（3）共轉染外源miR-21的m21CTA組，成功提高Fluc信號。

作者為測試不同的質粒添加比例對m21CTA系統的影響，在總質粒量恒定的條件下，設置了五種不同比例的質粒組合。結果發現，當PdCas9-VPR : PTRE-Fluc : PsgRNA質粒比例為2:2:1時，外源miR-21介導的系統激活倍數最高（5.5倍），因此後續所有實驗均以此比例進行（圖2 D，E）。另外，經濃度梯度實驗證實，Fluc活性隨外源miR-21濃度的增加而增強（圖2 F）。為進一步驗證mCTA系統的普適性，同樣構建了針對miR-9的m9CTA系統，並證實了miR-9對m9CTA系統的激活也具有濃度依賴性和特異性（圖2 G，H）。此外，在具有內源性高表達miR-21和極低表達miR-9的4T1細胞中評估了m21CTA系統和m9CTA系統，與對照質粒PTRE-Fluc相比，m21CTA系統的Fluc信號顯著提升29.42倍，而m9CTA系統則信號微弱（圖2 I），這一發現與293T細胞中獲得的數據結論一致。

圖2. 哺乳動物細胞中mCTA系統的驗證與優化

三、利用mCTA系統對細胞內源性miRNA變化表達進行活體成像監測

為了探究mCTA系統對內源性miRNA表達的變化監測效果，作者建立了P19細胞神經分化模型。隨着分化天數的增加，通過共聚焦顯微鏡觀察到神經標誌物MAP2的表達呈上升趨勢，表明分化細胞模型構建成功，且qPCR檢測證實miR-9的表達同步上調（圖3 A-C）。隨後，將m9CTA系統轉染至分化的P19細胞中，發現Fluc信號隨分化進程加快而逐漸增強。進一步將細胞移植至小鼠體內進行活體成像檢測，也觀察到了相同的狀況。這些結果表明m9CTA系統能有效可視化監測神經分化過程中miR-9的變化變化（圖3 D-F）。

圖3. 利用mCTA系統對miR-9進行活體成像

為驗證mCTA系統在深部組織的成像能力，研究轉向小鼠肝臟動物模型。經尾靜脈流體動力學註射向小鼠肝臟遞送mCTA系統，結果發現僅當外源miR-21 mimics與m21CTA系統同時註射時，小鼠肝臟才顯示出強Fluc信號；進一步構建肝臟特異性miR-122響應的m122CTA系統，當該系統遞送至小鼠肝臟時，因肝臟內源性高表達miR-122呈現出顯著的Fluc信號，而m9CTA組則信號微弱（圖4）。這些發現不僅證實了mCTA系統的深部組織成像能力，更為miRNAs變化監測供應了實用型工具。

圖4. 驗證mCTA系統的深層組織成像能力

四、探索mCTA系統在癌癥治療中的能力

除了對mCTA系統的成像性能研究外，作者還將mCTA系統的下遊基因Fluc替換為白喉毒素A片段（DTA），旨在通過腫瘤微環境內源miRNA的特異性激活系統達成靶向治療（圖5 A）。在高表達miR-21的4T1細胞中，與單獨轉染P7*TRE-DTA或m122CTA系統相比，轉染m21CTA系統可顯著誘導細胞凋亡、抑製細胞遷移（圖5 B-E）。隨後，在異種移植瘤模型中驗證mCTA系統在體內對腫瘤的治療效果，結果發現m21CTA對腫瘤生長具有顯著的抑製作用，且不影響小鼠的體重（圖5 F-I）。由此證實，mCTA系統可轉化為一種基於內源miRNA精準調控的腫瘤治療工具。

圖5. m21CTA系統在腫瘤治療中的應用

五、探討mCTA系統通過激活PDX-1基因治療糖尿病的應用

作者進一步探討了mCTA系統在代謝性疾病治療中的潛力。針對1型糖尿病（T1D）因胰島β細胞破壞而導致的胰島素絕對缺乏，作者策劃了基於肝臟特異性的m122CTA系統，該系統核心是通過激活肝細胞內源性PDX-1基因（胰腺發育關鍵因子），從而將肝細胞轉化為胰島β細胞（圖6 A，B）。為此，采用鏈脲佐菌素（STZ）構建了小鼠T1D模型，通過多項指標驗證了模型的可靠性：體重下降、胰島素分泌顯著減少、胰島β細胞嚴重受損，且ALT、CHO、CR水平顯著升高（圖6 C-H）。但經m122CTA系統治療後，小鼠模型的血糖指數顯著降低（圖6 I）。這一結果表明，mCTA系統具有治療T1D的潛力。

圖6. m122CTA系統在糖尿病小鼠模型中的治療應用

本研究成功開發了一類可定製的miRNA調控CRISPR-dCas9系統—mCTA，利用細胞特異性內源miRNA達成靶基因激活的時空精準調控。該系統兼具實時變化成像監測內源miRNA變化的性能，以及治療癌癥和糖尿病的潛力。mCTA可作為一種通用策略，適配其他CRISPR-Cas系統，以推動精準基因治療的擴展，未來必將在多種疾病的基因治療中取得重大進展。

圖形摘要：mCTA系統及其應用