Cellular & Molecular Immunology IF= 21.8丨矽肺中Lp-PLA2-ALCAT1-CL通路介導MoMacs分化為促纖維化表型的新機製

矽肺是一種由吸入二氧化矽（SiO₂）顆粒引起的慢性、進行性肺部疾病，其特征是肺組織中膠原蛋白沈積和纖維化，目前仍然缺乏有效的治療手段。有研究表明，單核細胞衍生的巨噬細胞 (Monocyte-derived macrophages，MoMac) 是導致肺纖維化最重要的效應細胞，然而，矽肺中MoMac的分化特征及其影響肺纖維化進展的機製尚不清楚。

2025年5月19日，首都醫科大學王辰院士、代華平教授在《Cellular & Molecular Immunology》雜誌上在線發表了題為“Targeting Lp-PLA2 inhibits profibrotic monocyte-derived macrophages in silicosis through restoring cardiolipin mediated mitophagy”的研究報告，揭示了Lp-PLA2-ALCAT1-CL通路在矽肺擴展過程中的作用機製，這一發現為開發針對肺纖維化的新型治療策略供應了理論依據和數據幫助。值得註意的是，在本研究中，作者使用了漢恒生物供應的自噬雙標腺病毒工具（mRFP-EGFP-LC3B）來觀察自噬體以及自噬溶酶體的形成。

接下來，讓我們一起來了解一下這篇文章吧。

通過scRNA-Seq和ST-seq分析矽肺中巨噬細胞簇和組織微環境的異質性

首先，通過對接受支氣管滴註SiO2後3、7、14、28和56天或PBS（0天）的矽肺小鼠的肺細胞進行scRNA-seq分析，確定了五個巨噬細胞亞群：TRAM、MertkhiMac、Spp1hiMac、S100a8/9hiMac和recMac。其中，Spp1hiMacs 呈現出與損傷和炎癥反應、IL-1β 分泌、膠原合成、轉化生長因子-β（TGF-β）信號通路以及平滑肌細胞增殖密切相關的促纖維化基因高表達特征。在矽肺病進展過程中，Spp1hiMacs的比例隨着疾病擴展持續增加，並主要局限於纖維化微環境。鑒於矽肺巨噬細胞亞群的比例及定位特點，後續重點研究Spp1hiMac亞群。

圖1. 通過scRNA-Seq 和 ST-seq 分析矽肺中巨噬細胞簇和組織微環境的異質性

Spp1hiMacs 處於未成熟分化狀態，並在矽肺進展過程中獲得促纖維化的潛力

對所有樣本巨噬細胞的擬時間分析顯示，Spp1hiMacs表現出持續性增加，這表明肺組織對Spp1hiMacs的重塑程度更大。Spp1hiMac標誌基因（Spp1、Mmp12、Pla2g7、Il7r和Il1rn）的表達水平在SiglecFloAMs中高於SiglecFhiAms，這表明Spp1hiMacs與SiglecFloAMs具有相似的特性，並表現出類似的未成熟分化特征。在矽肺病進展過程中，SiglecFhiAMs的比例下降，SiglecFloAMs的比例上升，這一趨勢與通過單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析觀察到的TRAMs和SpphiMacs的趨勢一致。

圖2. Spp1hiMacs 處於未成熟分化狀態，並在矽肺進展過程中獲得促纖維化的潛力

Pla2g7基因的持續表達對矽肺小鼠中Spp1hiMacs的促纖維化機製至關重要

將矽肺纖維化微環境的數據與巨噬細胞分化數據進行整合，最終篩選出11個關鍵基因 （Pla2g7、Spp1、Gpnmb、Cd68、Hmox1、Slpi、Ctsb、Ctsd、Tnfaip2、Psap和Lgals3）。對纖維化微環境中高表達基因的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡進行分析，識別出Pla2g7是一個富集於脂質代謝和炎癥相關性能的樞紐基因。免疫荧光檢測到其表達的Lp-PLA2蛋白在矽肺小鼠的纖維化區域中與巨噬細胞標誌物CD68共表達，此外，也觀察到Lp-PLA2與Cx3cr1和Siglec F在矽肺患者的纖維化肺組織中共定位。流式分析發現，SiglecFloAMs中的Lp-PLA2表達水平高於SiglecFhiAMs。單細胞RNA測序分析顯示，在從正常狀態向炎癥狀態再向纖維化狀態的轉變過程中，Spp1hiMacs中Pla2g7基因的表達水平上調。這些發現突顯了Pla2g7在調節巨噬細胞分化和矽肺相關纖維化中的關鍵作用。

圖3. Pla2g7基因的持續表達對矽肺小鼠中Spp1hiMacs的促纖維化機製至關重要

巨噬細胞特異性Pla2g7基因敲除對小鼠矽肺纖維化和巨噬細胞亞群的影響

作者構建了巨噬細胞特異性敲除Pla2g7基因的轉基因小鼠CreLyz2Pla2g7flox/flox，並進行微CT、HE染色和Masson染色檢測，發現CreLyz2Pla2g7flox/flox小鼠的肺部纖維化結節、炎癥浸潤和膠原沈積減少，同時纖維化標誌物表達降低。流式分析也觀察到CreLyz2Pla2g7flox/flox小鼠肺部浸潤巨噬細胞中促纖維化SiglecFloAM亞群減少，表明Pla2g7在調節巨噬細胞性能及參與矽肺病誘導的纖維化過程中發揮關鍵作用。

圖4. 巨噬細胞特異性Pla2g7基因敲除對小鼠矽肺纖維化和巨噬細胞亞群的影響

Pla2g7基因缺失抑製矽肺小鼠及SiO₂誘導的巨噬細胞分化

極化代表巨噬細胞的激活和性能執行，其中M1和M2極化對矽肺病的發生擴展具有重要作用。ScRNA-seq分析顯示，Spp1hiMacs與M2極化的相關性最強。免疫染色發現，在纖維化小鼠肺組織中，Lp-PLA2與腫瘤壞死因子α（TNF-α）和精氨酸酶1（Αrg1）存在強共表達，而TNF-α和Αrg1是M1和M2極化的標誌物。流式細胞術分析顯示，與Pla2g7fl/fl小鼠相比，SiO₂誘導後CreLyz2Pla2g7fl/fl小鼠肺部M1巨噬細胞（CD11c+ CD206-）和M2巨噬細胞（CD11c- CD206+）的比例顯著降低。Western blot實驗結果顯示CreLyz2Pla2g7fl/fl小鼠肺組織中誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-1β、Arg1和IL-10的表達顯著降低。此外，SiO₂誘導的小鼠骨髓衍生巨噬細胞（BMDMs）中iNOS、IL-1β、Arg1和IL-10的表達水平以及Stat6的磷酸化水平顯著升高，而Pla2g7沈默可抑製這一過程。然而，OE-Pla2g7與SiO₂在MoMac細胞系RAW264.7中協同作用，促進M1和M2極化。此外，SiO₂刺激的BMDMs和OE-Pla2g7轉染的RAW264.7細胞誘導了在共培養的MLE12細胞（通過上皮-間質轉化（EMT））和小鼠原代成纖維細胞（通過成纖維細胞-肌成纖維細胞轉化（FMT））的肌成纖維細胞表型，而沈默Pla2g7的BMDMs則抑製相關表型。

圖5. Pla2g7基因缺失抑製矽肺小鼠及SiO₂誘導的巨噬細胞分化

Lp-PLA2在SiO₂誘導的MoMacs中被轉運至線粒體，並促進細胞膜重塑，導致線粒體性能障礙

Lp-PLA2作為一種磷脂酶酶，通過催化脂質代謝來調節炎癥。ST 生態位富集分析顯示，脂質代謝通路在肺纖維化生態位中顯著富集。矽肺患者肺泡灌洗液中巨噬細胞亞群數量的增加也導致脂質代謝異常。隨後對矽肺組織中分離的巨噬細胞進行脂質組學分析，發現CL代謝存在顯著異常，表現為乙酰化水平和不飽和度升高。CL在賴氨酸心磷脂酰基轉移酶1（ALCAT1）作用下發生異常酰化及不飽和化，使CL更易發生氧化。CL是維持線粒體穩態的必需脂質，Lp-PLA2作為催化CL氧化和水解的關鍵酶，提示SiO₂誘導的巨噬細胞表型改變可能涉及Lp-PLA2對ALCAT1-CL代謝通路的調控作用及線粒體性能障礙。

WB分析顯示，SiO₂誘導的巨噬細胞線粒體內Lp-PLA2和ALCAT1的表達上調。免疫染色結果顯示Lp-PLA2與線粒體標誌物COX IV共定位。透射電子顯微鏡（TEM）顯示，對照組小鼠的巨噬細胞線粒體結構正常，而矽肺小鼠的線粒體則呈現腫脹和空泡化。敲低Pla2g7抑製了ALCAT1蛋白水平的升高，同時維持了SiO₂誘導的巨噬細胞線粒體膜電位並降低了線粒體活性氧（mtROS）水平。Pla2g7過表達則導致線粒體膜電位降低和mtROS水平升高，這一效應可通過si-ALCAT1轉染及CL過氧化物酶抑製劑SS-31處理恢復。此外，過表達Pla2g7的巨噬細胞表現出線粒體融合相關蛋白視神經萎縮1型（OPA1）和線粒體融合蛋白2（MFN2）的表達下降，以及線粒體分裂相關蛋白動力蛋白1（DRP1）和分裂蛋白1（FIS1）的表達增加，這些變化可通過沈默ALCAT1得到緩解，說明了Pla2g7在線粒體性能中的關鍵作用。

圖6. Lp-PLA2 在SiO₂誘導的 MoMacs 中被轉運至線粒體，並促進細胞膜重塑，導致線粒體性能障礙

Lp-PLA2-CL通路在SiO₂誘導的巨噬細胞及SiglecFloAM中誘導線粒體自噬性能障礙

線粒體自噬對線粒體品質控製至關重要。作者通過全細胞蛋白分析發現，在SiO₂刺激或OE-Pla2g7轉染後，巨噬細胞內的蛋白泛素化水平和LC3II水平均升高。線粒體損傷標誌物外線粒體膜轉運蛋白20（TOM20）和細胞色素C的表達也上調。抑製Lp-PLA2 或 ALCAT1 可增加 LC3II 的表達水平。作者又通過轉染EGFP-mRFP-LC3腺病毒來評估線粒體自噬的完整性，結果顯示SiO2誘導和OE-Pla2g7轉染後自噬體-溶酶體融合受損，這一狀況可通過Pla2g7和ALCAT1沈默得到緩解。使用自噬體-溶酶體融合抑製劑巴弗黴素A1 （Baf A1）和氯喹處理，結果發現可削弱CreLyz2Pla2g7flox/flox小鼠的抗纖維化能力，導致肺組織中TOM20、細胞色素C、 I型膠原蛋白和α平滑肌肌動蛋白的表達。此外，SiO₂誘導的CreLyz2Pla2g7flox/flox小鼠肺組織中SiglecFloAMs的比例低於SiO₂誘導的Pla2g7flox/flox小鼠。然而，SiO₂誘導的CreLyz2Pla2g7flox/flox小鼠在接受Baf A1治療後，SiglecFloAMs的比例有所增加。

研究還發現編碼溶酶體半胱氨酸蛋白酶B(Cathepsin B)的Ctsb基因在Pla2g7high細胞中高度表達。Cathepsin B在溶酶體完整時可降解溶酶體內容物，然而，當溶酶體受損時，Cathepsin B會轉運至細胞質，影響自噬流和TGF-β1的激活。在本研究中，發現敲除Pla2g7基因的矽肺小鼠中Cathepsin B的表達水平顯著降低。隨後對Cathepsin B和溶酶體標記蛋白Lamp1的檢測顯示，在OE-NC轉染的巨噬細胞中，Lamp1與Cathepsin B共定位，而在OE-Pla2g7轉染的巨噬細胞中，Lamp1水平下降，Cathepsin B分散於細胞質中，這一狀況可通過沈默ALCAT1逆轉。這些結果表明，矽肺病過程中巨噬細胞的溶酶體損傷至少部分由Lp-PLA2-ALCAT1通路調節。此外，Pla2g7和ALCAT1的沈默抑製了SiO₂刺激的和OE-Pla2g7轉染的RAW264.7細胞中Cathepsin B的增加以及TGF-β-Smad2/3通路的激活。這些結果表明，ALCAT1-Lp-PLA2通路破壞了線粒體自噬的完整性，從而通過調節溶酶體損傷來擾亂自噬流。

圖7. Lp-PLA2-CL通路在SiO₂誘導的巨噬細胞及SiglecFloAM中誘導線粒體自噬性能障礙

Lp-PLA2特異性口服抑製劑達拉普拉迪布可保護小鼠免受SiO₂暴露引起的肺纖維化

最後，通過一項隨機對照試驗，作者評估了口服Lp-PLA2特異性抑製劑達拉普拉迪布（darapladib）對SiO₂誘導的小鼠肺纖維化的療效。研究結果顯示，暴露於SiO₂後接受darapladib治療的小鼠，其肺性能顯著改善，且肺纖維化程度較溶劑對照組明顯減輕。WB分析顯示，SiO₂+darapladib達拉普拉迪布組小鼠肺組織中纖維化蛋白（I型膠原、α-SMA和TGF-β1）及炎癥蛋白（iNOS、Arg1、IL-1β和IL-6）的表達水平顯著低於SiO₂組，類似結果也通過ELISA獲得。此外，脂質組學結果進一步表明，達拉普拉迪布阻礙了CL的酰化和不飽和化。

圖8. Lp-PLA2特異性口服抑製劑達拉普拉迪布可保護小鼠免受SiO₂暴露引起的肺纖維化

綜上所述，該研究揭示了矽肺中單核來源巨噬細胞通過Lp-PLA2-ALCAT1-CL通路介導線粒體自噬缺陷，進而分化為促纖維化表型的機製，並證實Darapladib通過恢復心磷脂代謝和線粒體自噬抑製纖維化。這不僅深化了對矽肺發病機製的理解，也為其治療供應了理論框架。