APSB丨潘誌強團隊揭示NAT10調控ac4C修飾，或成為缺血性卒中治療新靶點

卒中是成人殘疾的主要原因，也是世界範圍內死亡的主要原因。根據2019年全球疾病負擔(GBD)的調查結果，卒中是1990年-2019年50歲及以上人群殘疾調整生命年(DALY)的首要原因之一。 據流行病學研究報告，缺血性卒中占所有卒中病例的85%。因此，缺血性卒中已被聯合國視為減輕非傳染性疾病負擔的優先目標。截至目前，用於促進中風恢復的治療藥物寥寥無幾。通過靜脈註射重組組織型纖溶酶原激活劑來溶解血栓是最常采用的治療方法，然而，這種溶栓療法的療效窗口狹窄，且存在一些副作用，限製了其應用範圍 。因此，如何修復受損腦組織或延長治療的療效時間窗口，依然是一個迫切需要解決的臨床問題。

2025年，徐州醫科大學潘誌強團隊團隊在  Acta Pharmaceutica Sinica B(IF=14.8) 上發表了題為：NAT10 inhibition alleviates astrocyte autophagy by impeding ac4C acetylation of Timp1 mRNA in ischemic stroke 的研究論文。研究團隊發現 NAT10 在缺血損傷後可調節星形膠質細胞自噬：NAT10 直接催化金屬蛋白酶組織抑製因子 1（Timp1）mRNA 的 ac4C 乙酰化，從而上調 TIMP1 並增強 TIMP1 依賴的自噬激活，揭示了 NAT10 介導的 RNA ac4C 修飾有助於缺血性卒中星形膠質細胞自噬。因此，NAT10 有望成為減輕缺血損傷梗死並促進性能恢復的潛在有效靶點。值得註意的是，在本研究中使用的自噬雙標腺病毒（AD-mRFP-GFP-LC3），以及特異性敲低星形膠質細胞Nat10、Timp1和Atg5基因的腺相關病毒均由漢恒生物供應。

下面，我們一起來了解詳細的研究內容：

1.急性缺血性腦卒中患者和腦卒中模型小鼠NAT10表達升高

在以往的研究中發現，早發卒中患者外周血的外泌體NAT10存在單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism）。為了探究 NAT10 是否參與了缺血性卒中的恢復過程，研究團隊收集了急性缺血性卒中（AIS）患者的壞死皮質組織和非卒中患者的皮質組織作為對照組。Wb結果顯示，AIS 患者的 NAT10 表達量高於對照組受試者。利用免疫荧光對腦組織切片中 NAT10 的表達情況進行評估，發現缺血性卒中患者的切片中 NAT10 表達強度增加。

為進一步證實上述的發現，作者構建了小鼠光化學誘導腦缺血模型（PT），第5天和第7天，梗死周邊皮質中的 NAT10 表達升高。PT後第5天進行免疫荧光染色，也觀察到梗死周邊皮質中 NAT10 的上調。此外，還在多個時間點（包括 PT 後6小時、第1天、第5天和第7天）評估了梗死情況，發現梗死體積在第5天達到最大值。彙總上述結果表明，卒中會增加梗死周邊皮質中 NAT10 的表達，提示 NAT10 可能參與了卒中後的病理過程。

圖1 急性缺血性腦卒中患者和PT小鼠的NAT10上調

2.藥理抑製NAT10可減輕PT小鼠梗死面積，促進性能恢復

接下來研究團隊將視角聚焦在NAT10在卒中後恢復中的作用。因為前述研究中發現PT小鼠在術後3天NAT10開始升高，所以決定從這個時間點開始連續口服remodelin（NAT10抑製劑）5天（P3-P7），觀察NAT10性能抑製後對卒中恢復的影響。Nissl染色結果顯示，remodelin治療組的梗死體積明顯減少。在行為測試中，remodelin組在網格行走測試中的表現與對照組相比有所改善（步伐錯誤減少）。類似的，在圓柱測試（cylinder test）中，在PT後的第8天，接受remodelin註射的動物前肢的使用不對稱性有所改善。同時，粘性去除測試（adhesive removal test ）也顯示了remodelin的顯著治療效果。彙總這些結果表明，在中風後的第3天到第7天抑製NAT10可以減少腦細胞的梗死和促進進運動性能恢復。

為了進一步明確NAT10在缺血性中風中的治療窗口，作者還檢查了在PT後3小時和6小時的NAT10表達情況。WB結果顯示，在梗死周邊區域，NAT10的表達在6小時增加。此外， Nissl染色觀察到remodelin可以通過抑製NAT10來減少梗死面積。鑒於課題的目的是為了改善卒中狹窄的治療窗口期，所以在隨後的所有實驗中，觀察在PT後的第3天到第7天使用藥物抑製NAT10的治療效果。

圖2 抑製NAT10可促進PT小鼠性能恢復

3.藥物抑製NAT10可減弱卒中後梗死區域星形膠質細胞的激活

接下來，研究團隊準備探究NAT10的潛在作用機製。使用免疫荧光染色標記腦組織不同類型的細胞發現，PT小鼠梗死區域的小膠質細胞中幾乎檢測不到NAT10，但在神經元和星形膠質細胞中含量豐富。小鼠PT處理後第3天至第7天給予remodelin 處理，WB顯示NeuN（神經元標誌物）的表達無顯著差異，但是remodelin 顯著下調了因PT誘導的GFAP（星形膠質細胞標誌物）和補體C3（神經毒性星形膠質細胞標誌物）的升高。免疫荧光也進一步證實了remodelin對星形膠質細胞的影響。由於不同表型星形膠質細胞的性能差異巨大，比如細胞毒性或神經保護，因此，研究團隊要闡明卒中情況下，NAT10對星形膠質細胞表型轉換的影響。發現PT導致梗死區域A1型星形膠質細胞相關基因（Ligp1、Psmb8、H2d1、Ggta1和Gbp2）的上調，remodelin抑製NAT10可以降低這些基因表達，而remodelin對A2型星形膠質細胞特異性轉錄本（Ptx3、Tm4sf1、Slc10a6、Cd14 和 Emp1）的表達沒有影響。此外研究團隊還發現，抑製NAT10顯著降低了PT小鼠缺血半暗帶區域的炎癥因子IL6和TNF-α水平。這些結果表明，NAT10促進了反應性星形膠質細胞的神經毒性。

圖3 抑製NAT10可降低梗死周圍神經毒性

4.星形膠質細胞靶向的NAT10消耗增強腦卒中後性能改善

接下來，作者繼續探究星形膠質細胞中NAT10對PT卒中後性能恢復的影響。在PT模型構建的前28天，通過腦定位註射將AAV-gfaABC1D-shNat10註射到預計會發生卒中壞死的位置特異性敲低星形膠質細胞中的NAT10，在卒中後的第7天對小鼠的性能恢復情況進行檢測。WB和組織切片觀察到AAV-gfaABC1D-shNat10顯著敲低了星形膠質細胞的NAT10水平。與對照組相比，敲低NAT10不僅能顯著減少PT的梗死面積，還顯著改善了缺血性性能障礙。這些結果表明，星形膠質細胞中NAT10的下調能改善PT小鼠的神經保護和性能恢復。

圖4下調星形膠質細胞的NAT10表達可促進PT小鼠性能恢復

5.抑製NAT10可降低ac4C水平和自噬

NAT10是唯一已知的mRNA ac4C修飾酶。因此，作者猜測NAT10可能通過對一些基因進行ac4C修飾，進而影響其在梗死區域的表達水平來發揮作用。Dot-blot結果表明，腦組織的缺血顯著增加了ac4C的水平，而NAT10抑製劑的使用能抑製ac4C在梗死區域的上升趨勢。已知NAT10 參與衰老過程中的自噬調控，研究團隊檢測了梗死區域自噬相關基因的表達水平，發現LC3B-II的水平升高，p62的水平降低，且NAT10抑製劑能逆轉這些變化。

接下來，作者考察了氧糖剝奪(OGD) 後星形膠質細胞中的ac4C、自噬是否和NAT10有關系。結果發現原代星形膠質細胞中NAT10表達量以OGD處理時間依賴性的方式上調。Dot-blot結果顯示，OGD也引起了ac4C水平增加，而這種效果能被 remodelin 抑製。同時，OGD的處理還促進了細胞自噬（LC3B-II增加和p62降低），而remodelin 能抑製此過程。研究團隊使用自噬雙標腺病毒感染小鼠原代星形膠質細胞，以評估NAT10對自噬流的影響。OGD處理的原代小鼠星形膠質細胞自噬流水平顯著增加，而經過remodelin 處理後復到了基礎水平，說明remodelin 可能通過抑製自噬流的方式來抑製LC3的表達，而不是阻斷自噬溶酶體的形成過程。

圖5 NAT10通過ac4C修飾參與自噬

6.NAT10促進PT小鼠梗死周圍皮層TIMP1的表達

在明確了通過抑製NAT10可以降低PT模型中ac4C水平後，研究團隊計劃進一步探索了乙酰化修飾可能作用的下遊基因。作者采用核糖體-新生肽鏈復合物測序技藝（ ribosome nascent-chain complex sequencing，RNC-Seq），篩選remodelin處理後的PT小鼠梗死區域翻譯不活躍的mRNA。與假手術組（Sham）相比，PT組有1535個轉錄本的翻譯效率顯著增加（倍數變化≥2；P<0.05），其中75個轉錄本在remodelin處理後與對照組（vehicle）相比翻譯效率顯著降低（倍數變化≤0.5；P<0.05）。因為之前的研究發現，NAT10和ac4C與自噬存在關聯，研究團隊對這些翻譯差異基因進行篩選，找到了TIMP1作為目標基因。qPCR發現，PT後Timp1表達顯著增加，remodelin誘導的NAT10抑製並未逆轉這一增加。然而，WB檢測發現remodelin處理顯著降低了TIMP1蛋白水平，表明NAT10可能通過調控Timp1 mRNA的翻譯效率來調節TIMP1表達。通過多聚核糖體分級實驗（polysome fractionation assay），作者發現OGD可增強小鼠原代星形膠質細胞中核糖體與Timp1 mRNA的親和力，而NAT10抑製後則阻斷了這一狀況。ac4C通常會識別mRNA上的“CXXCXXCXX”基序（“X”代表A、G、C或U），尤其是在CDS區，作者分析Timp1的mRNA序列找到了3個潛在位點，並將其命名為“a”、“b”和“c”位點。使用ac4C抗體免疫共沈澱的DNA片段進行分析，發現了位於CDS區的“c”位點序列，提示NAT10可能通過將ac4C引入到Timp1的c位點發生RNA修飾，來影響Timp1的翻譯效率。作者使用慢病毒感染原代星形細胞來過表達/敲低NAT10，通過免疫共沈澱發現過表達NAT10能增強NAT10與C位點的結合，表明NAT10很可能參與調節Timp1 mRNA的ac4C修飾。

圖6 NAT10通過ac4C修飾增強Timp1的mRNA來提高Timp1的翻譯水平

7.NAT10通過TIMP1調控OGD誘導的小鼠原代星形膠質細胞自噬

為證實TIMP1在缺血中對自噬的調控作用，研究團隊用siRNA敲低小鼠原代星形膠質細胞的Timp1，顯著降低了OGD誘導的LC3B-II和TIMP1的增加。此外，用Nat10慢病毒轉導星形膠質細胞可增強LC3B-II的表達，同時過表達Nat10並敲低Timp1則抑製了這種效應,說明TIMP1下調可能抑製因NAT10上調誘導的星形膠質細胞自噬。

為進一步確認ac4C對TIMP1蛋白翻譯的調控作用，研究團隊將NAT10與失活的 CasRx蛋白融合（dCasRx-NAT10），結合向導RNA（gRNA）將 ac4C 特異性地“寫入”C 基序。dCasRx-Nat10顯著增加了Timp1的ac4C水平，同時TIMP1和LC3B-II的表達量也顯著上調。這些數據表明NAT10通過ac4C修飾Timp1 mRNA來上調TIMP1表達，從而調控OGD誘導的自噬。

圖7 NAT10通過TIMP1調控星形細胞自噬

8.NAT10通過調節timp1影響卒中後腦性能的恢復

既然NAT10能通過TIMP1影響星形膠質細胞的自噬，那是否通過這一過程來影響卒中後的腦性能恢復呢？作者在PT前7天將dCasRx-Nat10慢病毒註射到皮質，同時註射gRNA將dCasRx-Nat10引導至Timp1的c位點，並在PT後第7天測試小鼠的性能恢復情況。Nissl染色顯示，通過遞送dCasRx-Nat10和gRNA，能顯著增加PT小鼠的梗死範圍，同時也加劇了缺血誘導的性能障礙（這通過網格行走、圓柱測試以及膠帶去除測試）。免疫荧光觀察發現利用gRNA-dCasRx-Nat10顯著增加了PT小鼠的GFAP陽性細胞的數量、提高了PT誘導的自噬水平。綜上所述，在PT卒中後，NAT10通過增強Timp1 mRNA的 ac4C修飾水平來上調TIMP1，而TIMP1的這種上調不利於受損大腦性能的恢復。

圖8  NAT10通過對TIMP1表達調控，影響PT老鼠腦性能恢復

為研究在星形膠質細胞中低水平TIMP1對大腦修復的影響，作者於PT手術前28天將AAV-gfaABC1D-shTimp1註射到預定的卒中部位，在PT後第7天檢測小鼠的性能恢復情況。與對照組相比，sh-Timp1顯著減少了梗死體範圍,緩解了PT損傷，表現為網格行走任務中失誤減少、圓柱任務中的前肢不對稱評分降低以及膠帶去除測試中花費時間縮短。這些結果表明，Timp1 mRNA可能是卒中後NAT10引起卒中後腦損傷的關鍵靶點之一。

圖9 下調星形細胞TIMP1的表達，可改善PT小鼠性能恢復

本研究不僅揭示了NAT10在缺血性中風中的關鍵作用，還提出了NAT10抑製作為一種新的治療策略的潛力。與目前的治療方法相比，基於NAT10的療法具有更寬的治療時間窗口，可以在中風發作後數天內進行幹預，這為臨床治療供應了更大的靈活性和實用性。此外，研究還強調了進一步探索NAT10和TIMP1在星形膠質細胞自噬中的詳細機製的重要性，這可能為開發新的治療靶點供應科學依據。總之，這項研究為缺血性中風的治療供應了新的思路和方向，具有重要的臨床意義和應用前景。