非編碼RNA幹貨-參與幾乎所有生理病理過程的miRNA

前面兩期為大家詳細展現了非編碼RNA中的lncRNA和circRNA，本期繼續為大家展現一種非編碼RNA：miRNA。本文將從miRNA的發現、結構、作用機製、性能、表達調控以及常用數據庫幾個方面為大家詳細展現非編碼RNA調控系列之miRNA的調控。

microRNA(miRNA)是真核生物中一類內源性的小非編碼RNA，長度約為17~25bp。自1993年被發現miRNA以來，小RNA範圍的進展和發現顛覆了科學界對基因調控的認識。從胚胎發育開始，到細胞凋亡，乃至腫瘤生長，miRNA在一系列生理和病理過程中發揮着重要的作用，各種遺傳、代謝、傳染病和腫瘤相關的miRNA為科學家進行病理研究供應了新的角度，可能成為可靠的疾病生物標誌物，科學家們也正積極地通過改變miRNA的性能、研制新的體內遞送方法，尋求對疾病幹預治療的手段，miRNA近來還被發現用於介導跨物種的進化與適應，另外的miRNA還有待探索。

一、miRNA的發現與命名

1993年，Victor Ambros和Gary Ruvkun分別領導的兩個實驗室在線蟲中發現了一種名為lin-4的基因^[1,2]。這種基因並不編碼蛋白，而是表達一種長度為22nt的小RNA，並且這種小RNA可以抑製一種核蛋白LIN-14基因的表達從而調節線蟲的發育。他們推測這種抑製的機製在於lin-4能夠與LIN-14 mRNA的3’ UTR區域上獨特的重復區域相互補。發生在線蟲第一幼蟲期末尾的這種抑製作用將啟動線蟲從第一幼蟲期向第二幼蟲期的發育轉變，因此這種小RNA又被稱為“小分子時序RNA（small temporal RNA，stRNA）”。

然而這一發現並未得到科學界的重視，只是被當做一個特例存在。下一個類似狀況的報道，是在七年之後的2000年。第二個被發現的miRNA被命名為let-7，長21nt，由Gary Ruvkun在對線蟲的研究中發現^[3]。同lin-4類似，let-7也能通過結合在一些靶基因（lin-14、lin-28、lin-41、lin-42以及daf-12）mRNA的3’ UTR區域上，從而調節線蟲的發育。Let-7的發現，以及當時RNAi範圍的興起，讓人們意識到這種調節性小RNA可能是一種廣泛存在的基因表達調控分子。在2001年10月，Thomas Tuschl、David Bartel和Victor Ambros三人分別領導的三個研究組在《science》雜誌同期發文，將這種小RNA命名為microRNA，簡稱miRNA^[4-6]。隨後的幾年裏，成千上萬的miRNA在各種物種（包括人類、小鼠、大鼠、果蝇、斑馬魚、擬南芥、水稻等動植物的幾乎所有類群）中被發現，開辟了一片全新而廣闊的科學研究範圍。

鑒於miRNA的迅速發現以及性能的闡明，迫切需要一個統一的命名規則與分析規範。來自Sanger研究所的科學家們在2002年開發了microRNA Registry，後更名為miRBase，為miRNA的研究供應了規範和方便^[7]。miRBase收錄的miRNA條目數從2002年的218個增加到2023年的271個物種，幾萬條記錄。而僅僅人類基因組所編碼的miRNA已經達到1917個。現在依然不斷有新的miRNA被發現。另外，我們從pubmed上梳理了miRNA從2001年重新被發現後該範圍所發表的論文，如圖1所示，年論文量從2001年的5篇增加到了2023年的13288篇，增加了2600多倍。

圖1. miRNA 自發現以來相關論文的數量變化

圖2. miRNA 的命名規則

二、miRNA的結構

miRNAs在細胞內是怎麽加工成熟的呢？miRNAs的加工成熟是一個經歷了細胞核到細胞質空間轉變、多種酶和輔助蛋白協調完成的受到多層次調節的多步驟精密反應^[8]。

RNA聚合酶最先合成的是miRNA的初始轉錄本（primary transcript），稱為primary miRNA（pri-miRNA）。Pri-miRNA一般長達數千nt，內部有莖環結構（stem-loop structure）。Pri-miRNA到最終的成熟體miRNA，需要經歷“切兩刀”。首先，pri-miRNA上的莖環結構會在細胞核中被RNaseIII型的核酸內切酶Drosha從初始轉錄本上切割下來，得到的長約65nt的小發卡結構稱為pre-miRNA。隨後，pre-miRNA被一個細胞核轉運蛋白exportin5（EXP5）轉運到細胞質中。抵達細胞質的pre-miRNA會被細胞質中另一種核酸內切酶Dicer切第二刀，形成一個22nt左右的雙鏈RNA。

需要特別說明的是，在miRNA的加工成熟中會發生一個鏈選擇（strandselection）的過程：選擇哪一條鏈被保留在RISC中去行使性能，哪一條鏈被丟棄。這個選擇的基本原則是：兩條鏈裏，5’端雙鏈相對更不穩定的那一條鏈傾向於被保留，而另一條鏈則會被丟棄然後降解。當然，這一規則並不嚴格，導致有的雙鏈的兩條鏈都可能被保留下來，這種時候需要在miRNA的序號後面加上5p或者3p加以區分。

圖3. miRNA的加工成熟途徑

miRNA是一類在進化上非常保守的基因，55%的線蟲miRNAs在人體內有同源分子，提示miRNA在進化上有重要意義，並且有着重要的生物學性能^[9]。約有40%的miRNA的基因位於編碼蛋白基因的內含子區域（內含子miRNA），與宿主基因（hostgene）共享啟動子和調節元件。約50%的miRNA持有獨立的非編碼轉錄本，其中約40%位於這些轉錄本的內含子區域，10%位於外顯子區域。

圖4. 五種pri-miRNA的結構

三、miRNA的作用機製

當miRNA被裝載到RISC復合物中後，便可以發揮其基因表達調控的作用。miRNA會通過其種子序列（5 ’端第2-8位核苷酸）識別靶基因mRNA 3’UTR上的結合位點，攜帶RISC發揮作用。miRNA的作用效果主要有三種：轉錄抑製（transcriptional repression），mRNA的切割或降解（mRNA cleavage or degradation）。

轉錄抑製涉及到一個重要的蛋白GW182。RISC有兩個核心組件：AGO蛋白和AGO結合蛋白GW182。GW182可以通過N端的GW結構域結合AGO蛋白，而它的C端的沈默結構域（silencing domain）可以形成一個大的平臺用以招募其它輔助蛋白，比如PABP、CCR4-NOT等。通過這些結合蛋白，可以在兩個層面抑製mRNA的翻譯。第一可以在轉錄起始之前，抑製40S核糖體小亞基和60S核糖體大亞基結合成80S的核糖體，從而阻止翻譯的起始。第二可以在翻譯延伸階段，阻止核糖體的前進，導致翻譯終止^[10]。

圖5. miRNA影響mRNA的三種方式

第二種影響mRNA水平的作用方式是miRNA介導的mRNA切割，但這種調節方式在動物中並不常見。因為動物體內的miRNA一般與靶基因匹配程度不高（除種子序列之外），而mRNA的切割需要miRNA與靶基因盡可能地完美匹配。切割作用的執行者是AGO蛋白。哺乳動物有四種AGO蛋白，分別是AGO1-4，其中有切割性能的只有AGO2。由於miRNA裝載到四種AGO蛋白的概率一致，所以要發生切割mRNA的反應，必須滿足兩個條件：miRNA被AGO2包裹並且能與靶基因很好的配對。

第三種影響mRNA水平的作用方式是 miRNA 介導的mRNA降解，這可能是miRNA 造成 mRNA 水平降低的主要方式。如圖5所示，當mRNA的正常轉錄受到抑製時，可能引發mRNA的脫帽、脫尾反應，然後引起mRNA從5’端或者3’端開始降解。

對于miRNA在mRNA上的結合位置，主要認為是在3’ UTR上。但是後來的研究表明，有的miRNA也能結合到5’ UTR甚至CDS區上行使性能^[11,12]。目前彙總已有的證據來說，結合到5’ UTR的miRNA常常起到翻譯激活的作用，這有可能是RISC復合物“撐”開了折叠的mRNA，方便負責翻譯的起始因子或核糖體的進入。而結合到CDS區的miRNA則跟結合到3’ UTR的經典負調控方式相同。比如Tay等人找到多個miRNAs可以結合到Nanog、Oct4和Sox2的CDS區，並且抑製這些蛋白的表達^[12]。

另外，對于 miRNA 的作用場所主要在細胞質，也有報道在細胞質加工成熟的miRNA可以重新進入細胞核發揮調節作用。

四、miRNA的性能

miRNA行使性能主要依靠上述方式抑製下遊基因表達，以這種間接方式來達成對生理病理狀態的調節。據估計，miRNA能調節人類近1/3的基因。而一個基因往往受到數個甚至數百個miRNA的調控（而這些估計主要是基於miRNA通過種子序列結合到靶基因 mRNA的3’ UTR這一基礎，如果考慮不同的結合序列以及不同的結合位點，這一數字將更為可觀）。因此，miRNA的基因調控作用將是一個復雜的網絡狀結構，如圖6所示^[13]。

圖6. miRNA調控網絡示意圖

這樣的結構會帶來兩個結果：首先一個miRNA的性能將非常廣泛，通過直接或者間接的調控，可以影響到很多生物學性能；而不同miRNA之間的相互配合又可以加強這種效果。但是，這樣又會造成 miRNA 性能的稀釋，使得每一個詳細靶點能受到某個miRNA的影響可能會變得很小；而不同miRNA之間也可能存在性能的抵消。又如圖7所示^[14]，作者區分了三類miRNA的靶點：“switch targets”、“tuning targets”以及“neutral targets”。其中 miRNA對於switch targets作用很強，抑製效率很高，為的是使這些靶點的表達維持在很低的水平。這些基因往往是特定時期需要表達的基因，一旦異常表達，危害很大。miRNA對於tuning targets只有較弱的抑製效果，為的是使這些靶點表達在一個合適的範圍內，既不太高也不太低。miRNA對於neutral targets作用不明顯，這些基因類似於管家基因，傾向於避免miRNA的調控。

圖7. miRNA和靶點調控關系的不同類型

miRNA的性能涉及到各種生理病理過程，包括：發育過程調節、抵抗病毒入侵、動物免疫性能調節、各器官/系統疾病以及腫瘤等。

1. miRNA與發育

miRNA最初就是在研究線蟲發育過程中被發現的^[15]。第一個miRNA，也是miRNA 調節發育過程的經典實例就是lin-4對它的靶基因lin-14的調節。除了lin-4，在線蟲發育過程中還有許多miRNA參與，包括著名的let-7，miR-48，miR-84和miR-241等等。Dicer酶敲除的小鼠在發育的第7.5天會死亡，提示miRNA在發育中有重要作用。

圖8. 線蟲發育過程中miRNA控製發育時序

2.miRNA與病毒

在長期進化過程中，有的miRNA擴展出抵抗病毒入侵的性能。而作為對手，某些病毒也進化出自己的miRNA系統或者學會利用宿主現成的miRNA系統，來幫助自己感染、增殖或者潛伏。miR-122是肝特異性表達的一種miRNA，它在抵抗HBV中有重要作用。miR-122可以直接結合到HBV的前基因組RNA上，抑製HBV的復製與翻譯。然而，miR-122卻能結合到HCV RNA的5’ UTR，促進HCV的增殖。另外，還有的病毒本身可以編碼miRNA，然後在宿主細胞內調節自身病毒基因或者宿主基因表達。

3. miRNA在代謝方面的作用

人體代謝反應的正常進行是生命活動得以發生的保障。miRNA在這一重要生命活動中也發揮着多種多樣的重要性能。上文提及的肝臟特異性miRNA—miR-122是第一個發現與代謝調控有關系的miRNA，它可以調節肝臟膽固醇和脂質的代謝。在另一項研究裏，在高脂餵食的肥胖小鼠裏下調miR-122後，小鼠肝臟膽固醇和脂肪酸的合成減少，脂肪的β氧化增加，循環系統的膽固醇和甘油三酯也發生減少，脂肪肝情況有所改善。另外，miRNA在胰島素和糖代謝方面也有重要作用，miRNA還可能調節胰島的發育，miRNA也參與脂肪細胞的生成和性能調節。

圖9. miRNA參與胰島素信號和葡萄糖代謝的調控

4. miRNA與腫瘤

miRNA參與了各種生命活動的調節，尤其在腫瘤發生擴展中有很重要的作用。在腫瘤發生擴展的每個環節，都有多種miRNA的參與^[16]。如圖10所示，在結腸癌中，miRNA的調控發生在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲遷移、血管形成、能量代謝和免疫逃逸等各個方面。在腫瘤發生擴展的不同階段，腫瘤細胞和患者血清中的miRNA表達譜都會發生特異的變化，可以用於疾病的診斷、預後及藥物效果的評估。

圖10. miRNA參與胰島素信號和葡萄糖代謝的調控

五、miRNA的表達調控

miRNA作為基因表達調控的重要開關，能參與幾乎所有生理病理活動。研究miRNA的時候，找到合適的研究miRNA的gain of function或者loss of function是必要的，這將對於我們理解生理病理活動、開發應用miRNA供應巨大幫助。

1. mimic/inhibitor

實驗室細胞實驗最常使用的，當屬miRNA的mimic和inhibitor了。miRNA的mimic和inhibitor是人工合成的RNA oligos，其中mimic是雙鏈，inhibitor是單鏈。mimic兩條鏈的3’端各帶2nt的懸垂堿基TT，其余序列完全互補，模擬天然經Dicer酶切割後的miRNA雙鏈；瞬轉入細胞，可以提高miRNA的含量。而inhibitor則是與相應miRNA完全互補的單鏈，瞬轉入細胞，可以結合細胞內的miRNA，從而達到封閉miRNA的目的，解除對靶基因的抑製。

但是這種方法也存在一定的局限性，瞬轉mimic提高了miRNA的含量達數十到數千倍之多，可能會造成結果的不準確性；另外，inhibitor並不能降低miRNA的表達，只是封閉了miRNA的性能，對檢測上有一定的難度。而有的性能可能需要較長時間段的miRNA含量改變才能表現出來，這時候，穩轉的方法改變miRNA的含量就顯得有了優勢。

2. agomir/antagomir

agomir/antagomir是在mimic和inhibitor基礎上，3’端增加了硫代膦酸和膽固醇的修飾，而每一個核糖也進行了2’-O甲基化修飾，提高了穩定性，也可以被用於體內實驗。但上述局限性仍然存在。

3. 質粒/病毒載體

使用質粒載體表達產生pri-miRNA或者pre-miRNA，然後經切割產生成熟的miRNA。這種方法的優點在於模擬了天然miRNA的成熟途徑，經過一系列細胞內的加工過程，使成熟的miRNA能有效地裝載到RISC中發揮作用。除此之外，還可以直接做成熟體的過表達，但其因為不是天然的結構，可能會存在不能正確剪切的可能。質粒載體再經過病毒包裝的步驟包出來病毒，就可以用在包含體內實驗和體外實驗等不同的實驗過程中。

做miRNA封閉呢，也可以用質粒或者病毒載體做。目前常用的有miRNA sponge技藝和miRNA antago技藝。miRNA sponge是利用miRNA-mRNA的相互作用，策劃出帶有串聯排列的miRNA結合位點的質粒載體，作為分子海綿吸附相應miRNA，解除對其靶基因的抑製。miRNA antago技藝也是利用miRNA-mRNA的相互作用，但只策劃含有一個miRNA結合位點的質粒載體。跟sponge比較，antago封閉miRNA的性能比較弱，正常情況下優先選擇miRNA sponge。

4. miRNA的敲除調控

針對於編碼基因的敲除，非3倍數堿基的插入/缺失會導致移碼突變，編碼提前終止等狀況，達成編碼基因的敲除，但這些通過影響編碼基因正確編碼的手段並不能對包含miRNA在內的非編碼RNA達到敲除效果。因此，要想達成miRNA的敲除，則需要在基因組上對miRNA的上下遊各策劃sgRNA，通過片段敲除的方式，達成miRNA敲除^[17]。

圖11. 使用cirspr/cas9技藝敲除miRNA

六、常用數據庫

做miRNA的研究，通過數據庫進行信息查詢或預測相關性能是必不可少的，下面是一些miRNA研究常用到的數據庫，可以查詢miRNA的基因信息、互作靶點等相關信息（表1）。

表1. miRNA常用數據庫匯總

本期內容從miRNA的發現和命名，結構，作用機製，性能以及調控等幾個方面對miRNA進行了詳細的展現，希望能對研究miRNA的小夥伴有所幫助，有興趣可以根據這些知識點深入拓展哦。漢恒生物可以供應各種形式的基因過表達和幹擾載體的構建、病毒載體的包裝，還可以供應miRNA與靶基因互作的雙荧光素酶驗證等效勞，恭迎有意向的小夥伴與我們聯絡。到此，我們對于非編碼RNA的展現到這裏就告一段落了，下期幹貨將為大家推送特異性基因表達調控幹貨知識，敬請期待！

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