非編碼RNA幹貨-LncRNA的生物學調控

上一期內容為大家展現了非編碼RNA調控概述 ，本期將從LncRNA的簡述類別、性能、常用數據庫、研究思路及性能調控等為大家詳細展現非編碼RNA調控系列之LncRNA的調控。

一、LncRNA的簡述及類別

1、LncRNA的簡述

長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA, LncRNA），一般指基因長度大於200nt的長鏈非編碼RNA的統稱。LncRNA主要是RNA聚合酶II轉錄的副產物，最早被認為基因組轉錄中的“噪音”片段，因此被認為不具有生物學性能。然而近年研究中發現，LncRNA是真核生物生命活動的重要組成部分^[1]。LncRNA在1991年首次被證實參與X染色體沈默，隨後被證實具有染色質修飾、轉錄調控、ceRNA調控等多種調控過程，LncRNA的調控作用也開始成為近年來研究的熱點。

2、LncRNA的類別

LncRNAs一般可根據其自身結構、定位、性能或與DNA/RNA/蛋白互作性能進行類別。我們今天主要展現通過其相對於附近蛋白質編碼基因的基因組位置^[2]，LncRNAs可分為：

1) 正義LncRNAs：與鄰近蛋白編碼基因轉錄方向相同，與編碼基因的一個/多個外顯子重叠；

2) 反義LncRNAs：與鄰近蛋白編碼基因轉錄方向相反，與相反鏈上的轉錄產物部分或完全互補；

3) 內含子LncRNAs：來源於編碼基因的內含子，由基因的內含子轉錄產生；

4) 基因間LncRNAs：由編碼基因之間的序列獨立轉錄；

5) 雙向LncRNAs：可同時從與鄰近蛋白編碼基因轉錄方向相同和相反2個方向發生轉錄；

6) 增強子LncRNAs：由蛋白質編碼基因的增強子區域產生。

圖1. LncRNA基因組位置類別^[3]

二、LncRNA的相關性能展現

LncRNA不只是基因組中的承接序列，另外是承擔了各種DNA、RNA及蛋白間調控性能的重要遺傳信息。LncRNA發揮性能主要依靠其二級結構，與蛋白質結合，可引起染色質重構、轉錄性能調控等。還可以通過ceRNA競爭機製，與靶基因mRNA競爭性結合miRNA，間接影響靶基因表達量。也可以通過與編碼蛋白基因的mRNA形成互補鏈，影響其剪切或翻譯結果。因此LncRNA的生物學性能明確了許多基因組復雜性表達調控的難題，接下來我們詳細的探索下LncRNA的主要性能：

圖2. LncRNA基因性能^[3]

1、LncRNA表觀遺傳學調控

1）LncRNA可以通過RNA-DNA或RNA-染色質相互作用，發揮表觀遺傳學調控性能。

2）LncRNA可以是染色質重塑蛋白打開或關閉染色質的支架。LncRNA通過共價修飾途徑直接與組蛋白或DNA修飾酶相互作用；也可以通過非共價調控，依賴ATP調控染色質重塑。

2、LncRNA轉錄翻譯調控

1）LncRNA可以通過順式/反式調節影響成熟mRNA的穩定性、差異剪接、修飾的編輯等。

2）LncRNA可以通過在翻譯過程中與核糖體或mRNA轉錄物結合來調節mRNA的翻譯。

3）LncRNA可以是轉錄因子激活/抑製的支架，其與轉錄因子的作用調控主要體現在LncRNA與蛋白的互作。由於LncRNA較長，確定LncRNA的作用區域是研究LncRNA-蛋白互作機製的關鍵步驟。

3、ceRNA機製調控

LncRNA通過堿基互補配對原則結合miRNA種子區域序列競爭性地吸附miRNA，從而阻斷miRNA與下遊靶基因的結合，進而影響下遊靶基因表達量的變化。作為競爭性內源性RNA，LncRNA可以導致miRNA性能的喪失或降低，並影響miRNA對靶基因的調控作用。

4、LncRNA編碼蛋白

LncRNA一般被認為在轉錄本中缺少開放閱讀框，不能被翻譯成蛋白質。但2011年，發表在 《Cell 》上的文章表明LncRNA可以被核糖體吸引，並通過檢測翻譯效率相關的數值，證明了其中一些LncRNA具有翻譯產生小肽的能力^[4]。在2020年的一篇研究中，研究團隊使用了眾多的宏觀組學的分析，包括ribosome profiling、mass spectrometry (MS)-based proteomics、microscopy以及 CRISPR-based genetic screening等方法^[5]，證明了在人類的細胞中數百個LncRNA能表達出穩定的微肽，並參與細胞的生命活動。研究揭示了編碼微肽與性能性調控RNA均可作為LncRNA的性能，發揮作用並不沖突。

三、LncRNA常用數據庫

了解LncRNA性能後，我們應該通過強大復雜的LncRNA數據庫進行相關信息或相關預測的查詢，下面是一些LncRNA研究常用的數據庫匯總，可以對應查詢到LncRNA的基因信息、亞細胞定位、SNP位點、編碼能力及相關疾病等（表1）。

表1. LncRNA常用數據庫

四、LncRNA的研究方案

熟悉了LncRNA的相關性能和常用數據庫後，就可以針對LncRNA展開詳細的實驗研究。LncRNA的研究思路主要分為三大部分：LncRNA靶點篩選、LncRNA性能研究以及LncRNA相關的機製研究，下面我們針對LncRNA的研究方案進行詳細說明。

圖3. LncRNA研究思路導圖

1、LncRNA靶點篩選

LncRNA靶點篩選需要先通過生物信息學分析、RNA-seq以及芯片技藝等對疾病模型/病例樣本進行LncRNA表達譜分析，用來發現和篩選差異性表達的LncRNA，並在疾病模型組織中進行驗證確認。由於LncRNA核定位概率較高，因此性能研究前建議確認LncRNA的亞細胞定位。

1）LncRNA發現與篩選

LncRNA篩選主要通過高通量LncRNA芯片、直接測序或生物信息學分析方法篩選差異表達的LncRNA，也可以通過生物信息學預測共表達網絡中相關的LncRNA靶點，進而確認其上下遊及關聯基因。

2）LncRNA差異表達驗證

通過QPCR方法檢測相關疾病模型組織或細胞中，LncRNA差異性表達及其本底表達情況，製定後續對應的性能研究方案。

3）LncRNA亞細胞定位

LncRNA較細胞質定位另外的是呈現出明顯的細胞核定位狀態。除了現有數據庫查詢和分析方式，一般需要通過FISH實驗對LncRNA亞細胞定位進行輔助驗證。

定位在細胞核的LncRNA，可以與細胞核內的DNA、RNA、蛋白質等分子相互作用，達成染色質重塑、mRNA剪接、轉錄調節等調控性能；

定位在細胞質的LncRNA，多在轉錄後水平達成對編碼基因的調控，調節mRNA翻譯或降解等，也可以參與細胞內復雜的信號通路網格的調控。

2、LncRNA的性能研究

篩選出差異表達的LncRNA，並利用QPCR、FISH等技藝，檢測LncRNA在細胞/組織中的分布和表達量變化。接下來需要通過過表達、敲低、敲除等調控方式來改變LncRNA的表達量，再通過觀察細胞和動物模型中相關性能的變化，來明確LncRNA的生物學性能。

1）LncRNA的過表達調控

將全長LncRNA合成並構建至非病毒載體（質粒、體外合成等）或者病毒載體（慢病毒、腺病毒、腺相關病毒等）上，以達成LncRNA的過表達調控。樣本組織中的表達水平：檢測不同組織以及不同階段的表達水平；細胞水平上的表達：檢測不同細胞中，LncRNA的表達水平。

2) LncRNA的敲低調控

敲低LncRNA的方式主要分為三類：a. 直接合成ASO；b. 直接合成siRNA靶點；c. 質粒載體或者病毒載體表達shRNA 。研究LncRNA敲低調控時，首要考慮其亞細胞定位情況，據文獻報道[6]，針對於細胞核定位的LncRNA，使用ASO明顯比siRNA起到更好的幹擾效果；針對於細胞質定位的LncRNA，siRNA發揮出了更明顯的幹擾調控優勢；而對於細胞核和細胞質同時定位的LncRNA，單獨使用siRNA或ASO都沒有前面兩種效果好，但聯合使用siRNA和ASO卻能達到更好的敲低效果。

圖4. LncRNA敲低工具效果對比圖^[6]

3）LncRNA的敲除調控

針對於編碼基因的敲除，非3倍數堿基的插入/缺失會導致移碼突變，編碼提前終止等狀況，達成編碼基因的敲除，但這些通過影響編碼基因正確編碼的手段並不能對LncRNA達到敲除效果。因此，要想達成LncRNA的敲除調控，則需要在基因組上LncRNA上下遊各策劃1個sgRNA，通過片段敲除的方式，達成LncRNA敲除的效果。

圖5. LncRNA敲除sgRNA位置^[7]

3、LncRNA的機製研究

1）LncRNA與DNA/RNA互作

RNA與DNA可以通過堿基互補配對形成RNA-DNA雜合鏈，這種互作形式對於細胞生命活動維持與遺傳信息調控具有重要生物學意義。綜述研究表示，RNA-DNA互作鑒定方法分為三種^[8]：a. 針對特定RNA的互作DNA鑒定：使用與目標RNA互補配對的探針進行pulldown，將富集到的DNA進行測序鑒定；b. 針對所有RNA-DNA互作的鑒定：采取兩種捕獲策略，一種是使用嵌合的RNA/DNA雙接頭，可以同步達成RNA和DNA的捕獲；另一種為分別捕獲互作的RNA和DNA；c. 針對特定DNA位點的RNA-DNA互作鑒定：采用dCas9策略富集與特定DNA區域互作的RNA。

LncRNA與RNA互作可以通過RNA pulldown、CHIRP等實驗方法。策劃與目標RNA序列反向互補的生物素探針，把目標RNA拉下來以後，則與其共同作用的RNA片段會被間接富集到鏈黴親和素磁珠上，最後通過qRT-PCR或測序來測定目的RNA。

2）LncRNA與蛋白互作

RNA pull down是用於檢測LncRNA結合蛋白與LncRNA互作的主要實驗方法。通過體外轉錄法標記生物素RNA探針，並與胞漿蛋白提取液共孵育，形成RNA-蛋白質復合物。復合物洗脫後，通過WB實驗檢測特定的LncRNA結合蛋白是否與LncRNA相互作用。

3）ceRNA機製

通過網絡數據庫miR CODE、LNCBase等預測LncRNA-miRNA-mRNA軸上相關的靶基因。確定靶基因後，通過miRNA的種子序列或自由能結合方式進行miRNA與LncRNA可能結合位點的預測，並通過雙荧光素酶實驗進行驗證。

本期內容針對LncRNA的簡述類別、性能、常用數據庫、研究思路及性能調控等四大方面進行了詳細展現，希望對LncRNA研究方向的小夥伴可以有所裨益。漢恒生物可以供應LncRNA過表達/幹擾/敲除載體的構建、以及LncRNA與miRNA/靶基因互作的雙荧光素酶驗證效勞等，並持有專業的技藝效勞團隊為您答疑解惑，有意向的小夥伴恭迎與我們聯絡~下期我們將繼續為大家展現另一種重要的非編碼RNA—circRNA，敬請關註！

參考文獻：

[1]   Lee JT. Epigenetic regulation by long noncoding RNAs. Science (New York, NY). 2012; 338(6113): 1435-1439.

[2]   Hermans-Beijnsberger S, van Bilsen M, Schroen B. Long non-coding RNAs in the failing heart and vasculature. Noncoding RNA Res. 2018 Apr 14; 3(3): 118-130.

[3]   Robinson EK, Covarrubias S, Carpenter S. The how and why of lncRNA function: An innate immune perspective. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 2020 Apr; 1863(4): 194419.

[4]   Ingolia NT, Lareau LF, Weissman JS. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 2011 Nov 11; 147(4): 789-802.

[5]   Chen J, Brunner AD, Cogan JZ, et al. Pervasive functional translation of noncanonical human open reading frames. Science. 2020; 367(6482): 1140-1146.

[6]   Lennox KA, Behlke MA. Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2016 Jan 29; 44(2): 863-77.

[7]   Han J, Zhang J, Chen L, Shen B, Zhou J, Hu B, Du Y, Tate PH, Huang X, Zhang W. Efficient in vivo deletion of a large imprinted lncRNA by CRISPR/Cas9. RNA Biol. 2014; 11(7): 829-35.

[8]   Li X, Fu XD. Chromatin-associated RNAs as facilitators of functional genomic interactions. Nat Rev Genet. 2019 Sep; 20(9): 503-519.