動物實驗用腺病毒是否有必要純化？

研究基因調控少不了動物實驗的驗證，腺病毒和腺相關病毒是動物實驗常用的工具病毒， 但腺相關病毒由於載體容量小，且初始表達量較低，當遇到目的基因較大或造模周期較短的情況時，腺病毒就成了首選。提到這個，你是不是有疑問，動物用的腺病毒和細胞用的腺病毒純化程度是否不同呢？需要哪些特殊處理呢？本期小恒將從重組腺病毒擴展歷史的角度來解答這些疑問。

腺病毒載體最初是如何誕生的呢？這就不得不提到上世紀60年前後世界上出現的大規模疫情了，在此期間，科學家在手術切除的兒童扁桃體中發現了一種病毒，該疫情“元兇”後被國際病毒命名委員會命名為腺病毒，這是一種沒有包膜的直徑為70~100 nm的顆粒，由252個殼粒呈20面體排列構成，其基因組以線性的雙鏈DNA形式存在。

將病原體改造為用於研究的安全載體，最主要的就是解析病毒特性以及基因組不同區域的性能。科學家發現病毒的復製周期可分為兩個階段，在早期階段，基因組的多個不連續區域被表達，包括ElA、E1B、E2、E3和E4。其中，ElA編碼的蛋白性能主要涉及控製病毒基因轉錄， E1B產物在病毒DNA復製、病毒和細胞mRNA代謝和蛋白質合成中發揮作用，E3雖然不是病毒復製所必需的，但其可能在調節宿主對病毒感染的免疫反應中起作用。因此，科學家們删去了E1和E3區域獲得了重組腺病毒（下文簡稱為腺病毒），使其可以安全有效地將目的基因傳遞至細胞或者動物體內[1]。

圖1 腺病毒結構示意圖

腺病毒誕生前，科學家們大多使用逆轉錄病毒和慢病毒進行疾病研究，然而這兩種病毒在動物體內感染效果不夠理想且會引起動物免疫反應，極大地阻礙了疾病研究進展。常規製備的腺病毒滴度高於逆轉錄病毒和慢病毒，同樣的註射量可以傳遞另外的病毒顆粒進入體內，科學家門認為這樣也許能夠改善感染效果，因此自然而然將目光投向了腺病毒。

20世紀90年代，科學家們在啮齒類動物體內使用腺病毒治療囊性纖維化，發表了大量相關研究論文，他們發現在實驗動物體內註射腺病毒後，雖然疾病癥狀有所減輕，但事實上腺病毒載體將基因傳遞至靶器官的效率不夠理想。除此之外，在基因轉移部位會以劑量依賴的方式發生炎癥[2]。

這些結果類似於動物對病毒感染的免疫反應，研究人員認為腺病毒或治療性基因產物本身會誘導細胞毒性T細胞，破壞被腺病毒感染的細胞，導致治療性基因的表達缺失和炎癥（圖3）。基於此，科學家進一步確認腺病毒會引起宿主的體液和細胞免疫反應，影響治療效果。

圖2 腺病毒引起的免疫反應[2]

於是，科學家從實驗各個節點排查腺病毒免疫原性的可能原因。他們發現，製備的腺病毒中通常含有人細胞蛋白、培養基中的牛血清蛋白和細胞碎片等雜質，這些雜質隨腺病毒一起進入動物體內會引起免疫反應；同時包毒過程中產生的缺損顆粒也會影響最終的感染效果。所以科學家開始嘗試多種方法去除雜質和缺損顆粒，以達到減輕腺病毒引起的免疫反應並提高基因表達效率的目的。

1994年，Yumi KANEGAE[3]等人發明了CsCl梯度純化方法，可將重組病毒、缺損顆粒和雜質有效分離，最終得到的病毒滴度得到了近10倍的提升，這意味着避免雜質引起的免疫反應的同時，相同的註射量可以傳遞另外的病毒顆粒至宿主體內，以提高病毒感染效率和基因表達效率。

之後科學家發現CsCl梯度純化方法最後增加透析步驟去除病毒中的CsCl後獲得的病毒更適用於動物實驗，但這一方法僅適用於小規模生產，而將腺病毒應用於臨床必然需要大規模標準化生產，為此科學家研制了層析純化方法並不斷改善，進一步提高了病毒的純度，可用於臨床試驗（圖4）。

圖3 腺病毒層析純化方法[4]

除了顯著降低宿主的不良影響外，純化後的腺病毒自身誘導的免疫系統的激活產生的免疫細胞數量大幅減少，進而被清除的病毒顆粒減少，最終進入靶器官或組織的病毒量增加，即使多次註射依然有較高的基因表達效率。

漢恒生物致力病毒包裝十余年，供應的純化腺病毒已助力多位老師發表高分文章，在這裏分享兩篇實例。

南京醫科大學第二附屬醫院的戴春筍研究團隊使用漢恒生物供應的純化腺病毒（Ad-DHHC9-HA）來研究蛋白棕榈酰化對肾纖維化的影響。作者通過肾實質註射將50 μL Ad-DHHC9-HA遞送至肾臟中，一段時間後取樣觀察發現過表達DHHC9可抑製疾病模型小鼠肾纖維化。

圖4 利用純化腺病毒在肾臟中過表達DHHC9[5]

華東師範大學的逢秀鳳團隊在《Journal of Clinical Investigation》期刊上發表了題為“BCL6 is regulated by the MAPK/ELK1 axis and promotes KRAS-driven lung cancer”的研究論文，其中使用了漢恒生物供應的純化腺病毒（Ad-Cre）構建基因敲除小鼠來研究肺癌。作者將LSL-KrasG12D和Bcl6flox/flox小鼠雜交，獲得LSL-KrasG12D/+&Bcl6+/+、LSL-KrasG12D/+&Bcl6+/flox和LSL-KrasG12D/+&Bcl6flox/flox小鼠，分別在三種小鼠中鼻內註射Ad-Cre，來觀察KrasG12D表達的條件下Bcl6不同的表達水平對肺部腫瘤的影響，發現敲除Bcl6後Kras誘導的腫瘤擴展受到顯著抑製。

圖5 Ad-Cre註射基因小鼠後腫瘤代表性圖像[6]

綜上，使用純化腺病毒用於動物實驗可以減輕宿主免疫反應，同時減少因免疫反應引起的病毒顆粒損耗，有助於提高基因表達效率，相比非純化的腺病毒更加安全有效，兩者的區別詳見表1。

表1 普通腺病毒和純化腺病毒的特點

到這裏相信各位對于動物用腺病毒是否需要純化已經有了答案，漢恒生物專業做腺病毒十多年，持有嚴苛的細胞培養環境（全程使用高品質Gibco血清、精選10代以內高活力293細胞、確保支原體檢測100%陰性）和嚴格的質控管理體系（病毒包裝全程嚴密監視、標準的滴度檢測流程，達標率不低於98%、CsCl梯度離心加透析純化），同時持有Adeasy和Admax雙包裝系統備選，確保項目高成功率。病毒滴度從1×10^10PFU/ml到1×10^11PFU/ml多規格可選，相比普通腺病毒，純化腺病毒滴度至少增加10倍，包裝過程中病毒損耗量達60%-70%，成本增加近30倍，價錢僅增加不到一倍。細胞實驗和動物實驗適用的腺病毒漢恒生物均可供應，恭迎各位老師咨詢~