CRISPR-Cas原理與工具，一文了解基因編輯魔剪CRISPR-Cas9系統

在前面幾期的幹貨分享中，我們主要展現了不同組織器官如何進行基因表達的特異性調控。接下來，我們將聚焦於基因魔剪CRISPR/Cas9基因編輯系統的研究。

基於細菌免疫系統CRISPR（clustered regularly interspaced palindromic repeat）改造擴展而來的CRISPR/Cas9 系統正在改變着生物學和基礎醫學研究，是現有基因編輯和基因修飾技藝中效率最高、最簡便、成本最低的技藝之一。CRISPR/Cas9的出現預示着一個新時代的到來，它允許人們輕易的在各種細胞和生物體中修改、調控或標記基因組位點，基因組層面的操作不再是實驗的瓶頸，它為生物和醫學的基礎研究鋪平了道路，並可應用於生物技藝的各個分支以及人類疾病的治療。今天我們將為大家講解CRISPR/Cas系統的由來，CRISPR/Cas9基因編輯的基本原理，並展現基於CRIPSR/Cas9的常用工具，以及遞送CRIPSR/Cas9進入靶細胞的有效手段。

一、CRIPSR/Cas系統的由來

CRISPR/Cas系統是原核生物的一種天然免疫系統，其工作原理是（圖1）：當細菌或古細菌首次遇到病毒、噬菌體等入侵時，含有CRISPR序列的細菌會獲得病毒的一段DNA序列，作為其內部重復序列之間的間隔區；當病毒再次入侵時，CRISPR序列會在前導區的調控下轉錄出pre-CRISPR-derived RNA (pre-crRNA） 和trans-acting crRNA （tracrRNA）。其中生物pre-crRNA最終會形成一段短小的crRNA ，crRNA與cas蛋白結合，通過堿基互補配對與入侵DNA結合，Cas蛋白發揮DNA內切酶的作用破壞病毒DNA序列，使其失活。

圖1. CRISPR/Cas系統的工作原理

對于CRISPR的發現（圖2），最早是在1987年Nakata等人在研究大腸桿菌的iap基因時，首次報告了在iap基因3’端結構域中發現了一段特殊序列，該序列由五個高度同源的序列組成，包含29個核苷酸，中間相隔32個核苷酸。在接下來的十多年中，研究人員繼續在細菌和古細菌中發現了類似的有規律間隔重復序列。2002 年，Janson等人對這些重復的DNA序列命名為“成簇規則間隔短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPRs）”。 CRISPRs附近的基因早先被理解為DNA修復系統的一部分，但後來發現它們主要與 CRISPR基因伴生，因此被稱為CRISPR相關（CRISPR-associated，Cas）基因。

2005年，Mojica等人發現細菌中的這種間隔序列大部分來自外源DNA，並且發現病毒更有可能感染沒有同源間隔序列的細胞，因此猜測CRISPR 參與了細菌抵抗外部噬菌體感染或質粒轉移等過程。這一猜測在隨後的2年也被報道證實。

在2011年Siksnys等人將CRISPR基因序列從嗜熱鏈球菌轉移到大腸桿菌中，發現含CRISPR基因序列的大腸桿菌可以抵抗質粒轉化，這也是CRISPR/Cas9在非宿主細菌中發揮作用的首次報道。2012年，Charpentier和Doudna利用Cas9達成了體外切割原核細胞DNA，並且闡明了CRISPR/Cas9的工作機製。2013年，麻省理工學院的華人學者張峰和哈佛大學醫學院的George Church分別發文報道了CRISPR/Cas9被成功用於哺乳動物細胞的實例。至此，CRISPR基因編輯技藝的研究得到了迅猛的擴展，為從醫學到農學等各個生物學範圍創造了巨大的應用價值。

在之後的研究中，研究人員通過解析Cas9的物理化學結構、Cas9切割雙鏈的作用機製等繼續賦予cas9新的性能。比如通過突變Cas9的結構域得到了nCas9、dCas9，將他們與一些效應因子（如轉錄調節因子、DNA甲基化修飾因子、脫氨酶、逆轉錄酶等）融合開發了新的調控工具：轉錄激活/抑製系統、單堿基編輯器（如胞嘧啶堿基編輯器-CBEs、腺嘌呤堿基編輯器-ABEs）和先導編輯-PEs等。此外，也發現了具有RNA識別和切割性能的Cas13a以及同樣具有DNA雙鏈切割性能的cas12a等多種類型的cas蛋白，極大的豐富了基因編輯類型。

圖2. CRIPSR/Cas系統擴展歷程

二、CRISPR/Cas9基因編輯的原理

核酸酶Cas9具有HNH和RuvC兩個DNA切割結構域（圖3A），其中HNH切割sgRNA靶向的DNA鏈，RuvC切割非靶向鏈。在sgRNA的引導下，Cas9定向切割目的基因，使DNA產生雙鏈斷裂（DSB）；然後經過細胞內源的DNA修復通路-非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）進行修復；最終達成對靶基因的敲除、插入和突變修飾等（圖3B）。

對Cas9分子結構的研究顯示，Cas9先與sgRNA結合，在sgRNA的引導下，其進一步與目標雙鏈DNA結合。Cas9的構象變化使靶向的雙鏈DNA解旋，sgRNA鏈侵入，從而特異性的結合與sgRNA互補的DNA鏈。機製研究還表明，靶向序列3’端的PAM序列對最初的DNA結合至關重要；如果沒有PAM，即使與sgRNA序列完全互補的靶序列也不會被Cas9識別。當序列完全匹配時，Cas9便發揮其核酸酶活性。HNH結構域和RuvC結構域分別切割一條DNA鏈，從而形成DNA雙鏈斷裂（圖3A）。而對這兩個結構域的其中一個進行突變，便可以獲得只能切割單鏈的nCas9（Cas9 nickase）；同時突變兩個結構域則可以獲得沒有切割活性的dCas9 (Cas9 Endonuclease Dead)。這兩種Cas9突變體被廣泛應用於構建各種遺傳操作工具。

Cas9切割產生的DNA雙鏈斷裂一般會被細胞內的DNA修復通路：NHEJ和HDR進行修復處理。NHEJ是一種易錯DNA修復方式，它能快速連接DNA斷裂缺口的兩端，但其容易導致缺口處發生短片段的缺失或插入，從而造成基因編碼區移碼（移碼突變：是指DNA分子由於某位點堿基的缺失或插入，引起閱讀框架變化，造成下遊的一系列密碼改變，使原來編碼某種肽鏈的基因變成編碼另一種完全不同的肽鏈序列），使靶標基因失去性能，從而達成基因敲除。HDR則通過引入donor模板進行精確修復，通過供應修復模板，可以在Cas9切割位點附近達成對內源基因的精準修復（點突變、蛋白標簽序列或荧光蛋白序列的插入、特定片段的删除等）（圖3B）。

圖3. CRIPSR/Cas9編輯原理（A）及Cas9蛋白切割原理（B）

三、基於CRIPSR/Cas9的常用工具

由於其穩健性和靈活性，CRISPR正在成為一種多性能工具，其應用不僅改變了基因編輯研究，也改變了許多其他基因組和染色質操作工作。正如前文提到的，這些應用大多利用了dCas9的可編程靶向能力，它不能切割DNA，但仍能被引導至靶序列。研究人員已將這些Cas9變體重新用於各種基因組靶向研究工作中（圖4）。

圖4. 基於CRIPSR/Cas9的常用工具

1. 基因表達調控工具：通過融合表達或招募的方式將轉錄激活或抑製因子帶到基因組的特定位點，以達成對特定基因表達的調控。由於dCas9能與DNA靶序列緊密結合，這種緊密結合會幹擾其他 DNA 結合蛋白的活性，如內源性轉錄因子和RNA聚合酶II。人們利用這一點開發出了CRISPR幹擾（CRISPRi）方法，其中dCas9的結合活性會阻斷轉錄過程，從而抑製基因的表達。再次基礎上，將 Kruppel-associated Box（KRAB）等強抑製因子復合物與dCas9融合可產生更強、更特異的基因抑製。相對的，使用dCas9靶向工具招募強轉錄激活因子可強力誘導基因表達。例如，將dCas9與VP64融合，VP64是由四個單純疱疹病毒的16個氨基酸大小的轉錄激活結構域（VP16）串聯組成，一些CRISPR基因激活工具進一步將dCas9與由VP64、P65和Rta（VPR）蛋白組成轉錄激活復合物融合，以達成更強效的基因表達效果。

2. 表觀修飾編輯工具：基因組中有多種表觀遺傳調控機製，如DNA甲基化、組蛋白翻譯後修飾等。其中，DNA甲基化是研究最廣泛的基因調控表觀遺傳機製之一。為了達成對DNA甲基化狀態的編輯，研究人員將 dCas9 與真核生物DNA甲基轉移酶（DNMT3A）或原核生物DNA甲基轉移酶（MQ3）的催化結構域融合，都觀察到了目標位點DNA甲基化水平的增加和基因表達的改變。同時，有針對性地招募抑製表觀遺傳機製的其它組分，如KRAB-ZNF、DNMT3L和多聚酶復合體，進一步增強了DNA甲基化和長期持續的基因抑製。相對的，如果dCas9招募TET蛋白（TET1、TET2和TET3）的催化結構域可達成特定位點的DNA去甲基化。例如，dCas9-TET1 融合復合物可導致高達90%的局部CpG二核苷酸發生DNA去甲基化，並顯著增加靶位點的mRNA表達。除DNA甲基化外，表觀遺傳信息還儲存在組蛋白中，例如，基因組中活躍的遠端調控元件在組蛋白H3的第4位賴氨酸（H3K4me1/2）上有單甲基化和二甲基化標記，染色質修飾受各種表觀遺傳寫入器（writers）、讀取器（readers）和擦除器（erasers）的變化調控。因此，利用多性能的dCas9工具，將各種組蛋白修飾因子招募到特定位點，可以達成對組蛋白修飾的改變。

3. 單堿基編輯工具：CRISPR技藝範圍的關鍵進展之一是單堿基編輯技藝的擴展。野生型Cas9會在目標位點造成DSB和Indel，與之不同的是，第二代基因組編輯工具能夠精確地將一個堿基轉換成另一個堿基，而不會造成DNA DSB。nCas9與APOBEC1脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑製劑（UGI）蛋白融合而成的融合復合物能有效地將目標位點的胞嘧啶（C）轉化為胸腺嘧啶（T），而不會造成DSB。另有研究將轉運RNA腺苷脫氨酶與nCas9融合，開發出另一種新型堿基編輯器，可在目標位點直接達成A-G轉換。這些新型堿基編輯方法大大擴展了基因組靶向的範圍。除APOBEC腺苷脫氨酶外，活化誘導腺苷脫氨酶（AID）也已可與dCas9酶融合達成C到T的編輯。

4. 染色質成像工具：dCas9技藝的進步也提高了活細胞染色質成像的效率和範圍。研究人員已利用荧光標記的dCas9靶向基因組的重復區域，達成了這些區域在細胞內的可視化。此外還可以通過與不同荧光蛋白融合的dCas9同源物的共同表達達成特定區域的雙色染色質成像，類似的方法被用於靶向端粒和核心粒的成像。將dCas9靶向非重復基因組位點更具挑戰性，因為自由漂移的荧光標記dCas9蛋白會產生背景荧光信號。因此，要達成非重復基因組區域的活細胞成像，通常需要轉染多達26-36個特異的sgRNA。另外，通過改造sgRNA支架，使其包含多個MS2結合模塊，也可達成荧光信號的增強。

表1. 漢恒生物cas9突變體相關商品

四、CRISPR/Cas9遞送工具

CRISPR/Cas9應用廣泛，根據目標細胞的不同，存在多種遞送方式（圖5），主要包括物理遞送方法（如顯微註射、電穿孔），化學遞送方法（如脂質納米顆粒、細胞穿透肽、多聚體），以及病毒遞送方法（如慢病毒LV、腺病毒Ad和腺相關病毒AAV）。遞送主要是將裝載編碼CRISPR/Cas9基因編輯系統的質粒或mRNA或sgRNA和cas9蛋白的RNP復合物遞送到體外細胞或動物組織細胞中，在細胞內sgRNA和cas9蛋白表達並達成對目的基因的編輯效果。

圖5. CRISPR/Cas9主要遞送工具

漢恒生物可供應用於CRISPR/cas9表達質粒遞送的脂質體轉染試劑，也可供應CRISPR/cas9表達質粒、慢病毒LV、腺病毒Ad和腺相關病毒AAV等相關遞送工具（表2）。

表2. 漢恒生物CRISPR/cas9遞送工具及質粒

本期對于CRISPR/Cas9系統展現到這裏就結束了，希望通過本期的展現能夠幫助大家更好地理解CRISPR/Cas9系統。下期我們將主要展現利用CRISPR/cas9系統進行基因敲除操作的相關分享，感興趣的小夥伴可以多多關註哦~~

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